■ 劉 策 曹清明 張立霞 刁其玉 屠 焰

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；2.中南林業(yè)科技大學食品科學工程學院，湖南長沙400041)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼料資源出現(xiàn)嚴重的緊缺，以至于出現(xiàn)“人畜爭糧”的情況，特別是蛋白飼料。因此開發(fā)新型的蛋白質(zhì)飼料資源成為人們關(guān)注的焦點。杏仁皮是杏仁的紅棕色或者深黃色的種皮。杏仁皮中含有11.4%～13.1%的粗蛋白質(zhì)、45%左右的碳水化合物[1]，具有成為新型飼料的潛質(zhì)。在工業(yè)中通過熱燙漂方法從杏仁中脫去杏仁皮，脫去的杏仁皮作為廢物丟棄，造成了很大的浪費也造成了環(huán)境污染[2]。如果直接飼喂，營養(yǎng)價值低、飼喂效果差。另外杏仁皮中含有一種重要的生物活性物質(zhì)——苦杏仁苷?？嘈尤受赵趧游矬w內(nèi)會分解成劇毒物質(zhì)氫氰酸，因此在飼用之前需要設(shè)法降低其含量以達到安全飼喂水平。如何提高杏仁皮等果皮廢棄物的飼用價值，解決對環(huán)境造成的污染，一直是困擾生產(chǎn)企業(yè)和科研應用技術(shù)人員的一個難題。國內(nèi)研究較多的是蘋果渣、馬鈴薯渣、甘蔗渣、啤酒糟等糟渣類產(chǎn)品的固態(tài)發(fā)酵利用[3]。目前該類產(chǎn)品的固態(tài)發(fā)酵應用存在著發(fā)酵原料資源有限、缺少發(fā)酵工藝參數(shù)的數(shù)學預測模型、缺乏飼料化固態(tài)發(fā)酵的行業(yè)標準等問題。微生物在適宜的生產(chǎn)條件下可降解果皮、果渣中難以消化的和有毒有害的成分[4]，選擇合適的菌種，進行飼料化生產(chǎn)，可以改善原料的營養(yǎng)價值，從而開發(fā)新型資源也能夠緩解飼料資源緊張的局面。本文通過復合菌的固態(tài)發(fā)酵來生產(chǎn)飼料蛋白，并對發(fā)酵工藝包括發(fā)酵菌種、發(fā)酵基質(zhì)、發(fā)酵條件優(yōu)化。使杏仁皮的營養(yǎng)價值得到改善，并且能夠成為新興的飼料資源。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

黑曲霉Aspergillus niger CICC2103；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC1017，購于中國微生物菌種保藏中心;枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis為中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所保藏菌種。

1.2 杏仁皮原料

杏仁皮原料由張家口市萬全縣洗馬林鎮(zhèn)禾久果仁加工廠提供，干物質(zhì)（DM）98.12%,粗蛋白（CP）11.34%、中性洗滌纖維（NDF）53.23%、酸性洗滌纖維（ADF）45.56%、粗脂肪(EE)10.34%、灰分(Ash)5.43%。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基

黑曲霉：孢子懸濁液，調(diào)整濃度107個/ml；啤酒酵母：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基；枯草芽孢桿菌：營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵待優(yōu)化培養(yǎng)基

杏仁皮10 g、麩皮2 g、尿素0.15 g、硫酸銨0.15 g、磷酸氫二鉀0.1 g、硫酸鎂0.02 g。此培養(yǎng)基配方參照吳綿斌[5]的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)酵工藝流程

杏仁皮→粉碎→加入麩皮→滅菌→冷卻→接種種子培養(yǎng)基→調(diào)整初始水分→恒溫固態(tài)發(fā)酵→烘干→發(fā)酵杏仁皮。

1.4.2 發(fā)酵菌種優(yōu)化

1.4.2.1 將黑曲霉（A）、啤酒酵母(S)、枯草芽孢桿菌(B)的種子培養(yǎng)基各3 ml以及黑曲霉+枯草芽孢桿菌（A+B）、黑曲霉+啤酒酵母(A+S)、枯草芽孢桿菌+啤酒酵母(B+S)、黑曲霉+枯草芽孢桿菌+啤酒酵母(A+B+S)不同組合配比的混合菌液各3 ml分別加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,進行單菌發(fā)酵及復合菌試驗。并且設(shè)置空白組不添加任何菌液一起發(fā)酵,每個試驗組4個重復。

1.4.2.2 將黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母三種菌液的種子培養(yǎng)基分別按照1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，2∶1∶1，1∶2∶2，2∶2∶2，2∶1∶2體積比例制成復合菌液各3 ml添加到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行不同菌種比例的發(fā)酵,每個試驗組4個重復。

1.4.3 發(fā)酵基質(zhì)配方優(yōu)化

以10 g風干基礎(chǔ)的杏仁皮作為基礎(chǔ)，正交優(yōu)化麩皮、硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂五種發(fā)酵輔料的添加量。其中麩皮的添加量設(shè)置1.0、1.5、2.0、2.5 g 4個水平，硫酸銨、尿素分別為0.1、0.2 g，磷酸氫二鉀為0.05、0.10 g，硫酸鎂為0.01、0.02 g。進行L8（4×24）混合正交試驗，共計8個處理組，每個處理組4個重復。

1.4.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.4.1 單因素優(yōu)化

分別對接種量(5%、7.5%、10%、12.5%、15%)，發(fā)酵溫度(25、28、30、33、37 ℃)，發(fā)酵時間(1、2、3、4、5 d)、料水比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5(w/v)）4個因素進行單因素優(yōu)化，每個因素每個水平為1個處理組，每個處理4個重復。

1.4.4.2 響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及Box-Behnken實驗設(shè)計原理，選取3因素3水平進行試驗，共15個試驗處理，每個試驗處理組4個重復。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 工藝優(yōu)化以真蛋白含量作為唯一優(yōu)化指標。真蛋白含量的測定：將發(fā)酵后培養(yǎng)基洗滌脫去可溶性氮之后，按照半微量凱氏定氮法（GB/T12091-1989）測定粗蛋白含量，所得結(jié)果即為發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量。

1.5.2 發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)變化。將發(fā)酵后的樣品使用粉碎機粉碎，過40目篩。DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash采用張麗英的飼料測定方法[6]，苦杏仁苷含量測定參照李強[7]使用的紫外分光光度法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示。并且采用SAS 9.2軟件包中的one-way ANOVA過程對單因素試驗的結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析，均值的多重比較采用Duncan氏法進行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準；以Box-Behnken進程對響應面設(shè)計進行二次響應面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵

表1 接種單菌及復合菌發(fā)酵后的培養(yǎng)基真蛋白含量(%)

由表1可知，單菌發(fā)酵試驗中，黑曲霉組的固態(tài)發(fā)酵效果最好。該組發(fā)酵后培養(yǎng)基的真蛋白含量顯著高于枯草芽孢桿菌組和釀酒酵母組（P＜0.05）?？梢詫⒑谇沟染N作為發(fā)酵菌種使用。由表1復合菌種的發(fā)酵結(jié)果可知，黑曲霉參與的發(fā)酵組A+B組、A+S組、A+B+S組的培養(yǎng)基的真蛋白含量顯著高于B+S組（P＜0.05）。A+B+S組培養(yǎng)基的真蛋白含量高于A+B組和A+S組，但是差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同菌種比例添加發(fā)酵后的培養(yǎng)基真蛋白含量(%)

由表2不同比例菌株的固態(tài)發(fā)酵結(jié)果可以看出，2∶1∶1試驗組高于其他各組，因此可以使用黑曲霉作為優(yōu)勢菌種，其余兩種菌株作為輔助菌種。可以選擇2∶1∶1的比例作為三種菌液的混合比例。

2.2 發(fā)酵基質(zhì)優(yōu)化試驗

表3 發(fā)酵基質(zhì)混合正交試驗

由表3可知，根據(jù)K值和極差的結(jié)果分析，得到正交試驗的最優(yōu)組合為A2B2C2D2E1，即麩皮1.5 g、尿素0.2 g、硫酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、硫酸鎂0.01 g發(fā)酵效果最好。發(fā)酵基質(zhì)的成分中，各成分的影響因排序為A＞C＞E＞D＞B?？梢允褂么伺囵B(yǎng)基配方作為優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗優(yōu)化（見表4）

單因素試驗的結(jié)果可以看出，隨著菌液添加量從2 ml提高到4 ml，發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量逐漸增大(P＜0.05)。但是大于4 ml之后，發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量變化不顯著(P＞0.05)。發(fā)酵時間的單因素試驗中，在前5 d發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量逐漸增大，第5 d發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量開始降低，第4 d、第5 d的培養(yǎng)基真蛋白含量差異不顯著(P＞0.05)。不同的初始水分含量對于發(fā)酵至關(guān)重要，添加15 ml蒸餾水的發(fā)酵組的培養(yǎng)基的真蛋白含量顯著高于其他各組(P＜0.05),說明該初始水分含量下最適合黑曲霉等微生物的生長。發(fā)酵溫度在28～30℃之間，發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量最大。但是在整個溫度變化范圍內(nèi)差異皆不顯著(P＞0.05）。同時考慮實際情況，可以將溫度設(shè)定為30℃，不再作為響應面優(yōu)化的因素之一。

表4 單因素試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量

2.3.2 響應面優(yōu)化

為了證明各發(fā)酵條件的交互效應，在30℃的發(fā)酵溫度下研究發(fā)酵時間、菌液添加量、水分添加量三者之間的相互作用關(guān)系，進行響應面優(yōu)化。采用3因素3水平的響應面分析方法,對各個因素做進一步優(yōu)化。響應面試驗設(shè)計和試驗結(jié)果如表6、表7所示。

表5 響應面試驗設(shè)計

表6 響應面試驗結(jié)果

由表7方差分析可知，選擇二次響應面模型擬合固態(tài)發(fā)酵條件模型，模型的P＜0.05,說明該二次響應模型可以描述三因素的交互作用。其中該模型的一次項A、B、C及二次項A2和B2對于模型的曲面效應顯著（PA=0.007 9，PB=0.029 8，PC=0.025 7，0.046 4)。矯正決定系數(shù)2，說明有95.02%的擬合度，可以使用該模型進行預測。利用軟件得到的二次響應面回歸方程：Y（真蛋白含量，%）=14.69-0.64 A+0.43B+0.34C-0.27AB+0.47A C-0.050 B C-0.24 A2-1.14 B2-0.35 C2。當 A=-0.79、B=0.28、C=-0.07時，有Ymax=18.24%。即當按照接種量10.19%、料水比1∶1.64、發(fā)酵時間3.93 d時發(fā)酵培養(yǎng)基有最大真蛋白含量?？紤]實際情況可以按照接種量10.2%、料水比在1∶1.6（w/v）、發(fā)酵時間4 d時的發(fā)酵效果最好。

表7 響應面試驗方差分析

2.4 發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)的變化

表8 原杏仁皮與發(fā)酵杏仁皮營養(yǎng)成分測定結(jié)果(風干基礎(chǔ))(%)

營養(yǎng)物質(zhì)的變化如表8所示，發(fā)酵前后的杏仁皮樣品DM、Ash含量差異不顯著（P＞0.05）,變化不大。杏仁皮經(jīng)發(fā)酵后EE含量顯著降低，CP及TP顯著地提高（P＜0.05）。NDF及ADF的含量都有所減少，但是差異不顯著（P＞0.05）。作為杏仁皮中苦味及毒素的來源，苦杏仁苷的含量顯著地減少（P＜0.05）。

3 討論

3.1 菌種優(yōu)化

生產(chǎn)杏仁皮蛋白飼料要解決微生物利用纖維素碳源的問題。絲狀真菌能夠利用纖維類物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化[8]。黑曲霉能夠釋放纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶，而且生長快、適應能力強。黑曲霉在固態(tài)發(fā)酵降解皮渣類產(chǎn)品的作用[9]。釀酒酵母能夠產(chǎn)生豐富的菌體蛋白，是發(fā)酵飼料富蛋白化的重要菌種[10]?？莶菅挎邨U菌作為細菌也常常用于固態(tài)發(fā)酵。

本試驗證明，有黑曲霉參與的處理組的發(fā)酵效果好，這應與其生產(chǎn)真菌菌絲體所提供的大量菌體蛋白有關(guān)。數(shù)據(jù)還顯示，復合菌發(fā)酵的效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵，文獻報道中[11-13]也采用了絲狀真菌+細菌+酵母菌的菌種組合來生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料。根據(jù)試驗結(jié)果，可將黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母三種子培養(yǎng)基以2∶1∶1的體積添加入發(fā)酵體系中，發(fā)揮黑曲霉的優(yōu)勢菌種的地位，以枯草芽孢桿菌及釀酒酵母作為發(fā)酵輔助菌種，可以作為發(fā)酵菌種的比例。

3.2 發(fā)酵基質(zhì)優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵體系中需要為微生物生長提供適當?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)。本文選擇麩皮作為主要發(fā)酵輔料，它可以同時作為碳源和氮源也能提供維生素和礦物元素[14]，其多孔狀結(jié)構(gòu)可以提供需氧環(huán)境。同時選擇尿素、硫酸銨作為氮源，選擇磷酸氫二鈉作為酸堿調(diào)節(jié)劑，選擇硫酸鎂作為礦物元素來源。這參考了關(guān)于生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料的報道[13，15-16]。

本試驗的正交優(yōu)化結(jié)果為，使用麩皮1.5 g、尿素0.2 g、硫酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、硫酸鎂0.01 g發(fā)酵效果最好。另外，通過試驗結(jié)果可以看出，微生物利用硫酸銨的能力要優(yōu)于尿素。原因可能是尿素溶于水的堿性破壞了微生物生長微酸環(huán)境[17]。在試驗中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵后期尿素的分解，基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生了不愉快的氨味。因此對化學合成的輔料尤其是尿素的使用量需要嚴格控制。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化包括菌液添加量、發(fā)酵溫度、料水比、發(fā)酵時間等因素的優(yōu)化。

每種微生物都有一個適合的生長溫度范圍。但是，不選擇溫度作為響應面優(yōu)化的因素，其原因有二，一是從試驗數(shù)據(jù)來看，溫度的變化差異不顯著（P＞0.05）；二是考慮實際生產(chǎn)，對于許多中小型杏仁加工廠，發(fā)酵環(huán)境溫度的調(diào)控極為復雜，甚至有些工廠不能保證恒溫條件[18]。因此可以將溫度設(shè)定為30℃，而不作為響應面優(yōu)化的因素之一。

適當?shù)慕臃N量可以縮短發(fā)酵時間，過度的接種量導致菌體生長過快、過稠，造成營養(yǎng)物質(zhì)的缺失。本試驗結(jié)果可知，添加10.2%復合菌液發(fā)酵培養(yǎng)基的真蛋白含量最高。許多生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料的文獻[19-21]中，也報道10%左右的菌液添加量為最佳接種比例。

水分含量的動態(tài)觀測和控制是難以做到的，可以控制初始水分含量。不同物料對于水分的保持能力不同，沒有統(tǒng)一的標準和要求。本試驗通過優(yōu)化得到料水比1∶1.6（w/v）發(fā)酵效果最好。

3.4 營養(yǎng)成分變化

通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，在提高蛋白質(zhì)含量的同時，能夠改變其他的營養(yǎng)物質(zhì)的組成，提高了飼用價值。張乃峰等[4]使用復合釀酒酵母生產(chǎn)蘋果渣發(fā)酵飼料，發(fā)酵后粗蛋白含量增大,NDF、ADF的含量減少，同時抗營養(yǎng)因子單寧和農(nóng)藥殘留的含量也降低。

本文復合菌的固態(tài)發(fā)酵后，真蛋白含量及粗蛋白含量顯著提高、NDF和ADF也一定程度的減小。作為杏仁皮中的苦味來源—苦杏仁苷含量也顯著的降低。由此可以將杏仁皮發(fā)酵飼料其作為新的發(fā)酵飼料使用。

4 結(jié)論

①以黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母三種菌種作為杏仁皮發(fā)酵蛋白飼料的固態(tài)發(fā)酵菌種，并以2∶1∶1的比例混合下發(fā)酵后培養(yǎng)基的真蛋白含量最高。

②發(fā)酵輔料與杏仁皮的最優(yōu)比例為：杏仁皮10 g、麩皮1.5 g、尿素0.2 g、硫酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、硫酸鎂0.01 g。

③以真蛋白含量作為優(yōu)化指標。得到結(jié)果是接種量 10.2%、料水比在 1∶1.6（w/v）、發(fā)酵 4 d時在30℃時發(fā)酵效果最佳，優(yōu)化后真蛋白含量提高到18.24%。

④固態(tài)發(fā)酵提高了杏仁皮的真蛋白及CP含量、苦杏仁苷含量降低，以杏仁皮為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料是切實可行的。