■葛晨霞 王秋舉 董曉慶 陳玉珂 張東鳴

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春130118）

L-肉堿作為一種水溶性類維生素的新型功能性添加劑在水產(chǎn)飼料行業(yè)應(yīng)用廣泛，它具有促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長、提高飼料利用率、抗應(yīng)激等多方面的生理作用。目前，L-肉堿也被視為一種營養(yǎng)保健產(chǎn)品和減肥產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和制藥行業(yè)，其保健功能越來越受到人們的重視[1]。由于水產(chǎn)動(dòng)物攝食的特點(diǎn)和L-肉堿易溶于水的特性，添加到飼料中的L-肉堿在水體中浸泡的時(shí)間是否會有溶失[2]，以及水煮處理是否會對魚類肌肉中L-肉堿造成損失等問題國內(nèi)外相關(guān)研究較少。本研究通過兩個(gè)試驗(yàn)，研究了不同處理?xiàng)l件對魚類肌肉和飼料中游離肉堿含量的變化，為盡可能減少魚肌肉在烹飪及飼料投喂過程中L-肉堿損失，最大程度被人體和水產(chǎn)動(dòng)物所吸收利用，最大程度發(fā)揮肉堿的營養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料

本試驗(yàn)選擇6種優(yōu)良淡水魚：草魚（草食性）、鰱魚（濾食性）、鯉魚（雜食性）和鱖魚（肉食性）、鯰魚（溫水魚）、虹鱒（冷水魚），2013年7月購自長春市新城大街農(nóng)貿(mào)市場，均為個(gè)體中等偏大的鮮活魚。設(shè)置水煮時(shí)間為5、15 min組和30 min組，每組3重復(fù)。

以魚粉為蛋白源，根據(jù)Fucxen[3]鯉魚飼料的最適L-肉堿添加量為100～400 mg/kg，確定在本試驗(yàn)飼料中添加L-肉堿量為200 mg/kg。將空白組飼料和肉堿組飼料分別置于蒸餾水中浸泡10、30 min和60 min，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水煮方法

參照楊銘鐸等[4]方法，略作修改。稱取清洗瀝干的生魚肉20 g置于已煮沸的裝有500 ml蒸餾水的燒杯中，于電爐上進(jìn)行水煮，從煮沸時(shí)(水溫100℃)開始計(jì)時(shí)，采用繼續(xù)加熱水煮5、15、30 min。水煮過程中添加100℃蒸餾水確保體系總質(zhì)量不變，冰水浴急速冷卻至室溫。肉塊取出后立即放置冰塊上，用濾紙吸干表面水分，冷卻后裝入自封袋，置-80℃冷凍備用。

1.2.2 飼料制作

按照生產(chǎn)工藝包括配料、粉碎、攪拌、混勻、熟化、調(diào)質(zhì)、制粒、包膜、冷卻、干燥等過程（各飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按配方稱重、采用逐級擴(kuò)大的方法均勻混合，用小型制粒機(jī)加工成直徑為2.5 mm的顆粒，晾干）制作的顆粒飼料，晾干后置于-20℃冰柜中保存、備用。飼料配方及營養(yǎng)成分見表1和表2。

表1 試驗(yàn)的飼料配方(%)

表2 試驗(yàn)的基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)水平

1.2.3 飼料浸泡

參照陳四清等[5]及郭沛涌等[6]方法，略作修改?？紤]操作條件對L-肉堿測定的影響，試驗(yàn)采用蒸餾水靜止浸泡，以保證試驗(yàn)條件的一致。準(zhǔn)確稱量10 g顆粒飼料（精確至0.000 1 g），置于自制圓筒形300目網(wǎng)篩中，浸于內(nèi)盛400 ml蒸餾水的燒杯中，在水浴鍋中，于水溫25℃條件下保持恒溫，分別浸泡10、30、60 min，然后用鑷子輕輕夾取，收集殘留飼料，晾干，于105℃烘干，冷卻后，放置于干燥器中保存，備用。

1.2.4 樣品前處理

魚肉、飼料中游離肉堿的提取參照Miyasaki等[7]方法，略作修改。準(zhǔn)確稱取魚背肌和飼料0.3 g，于精密離心管中。加入3 ml的6%高氯酸溶液和0.02 mol/l 2-巰基乙醇混合液，用超聲波破碎儀勻漿1 min。4℃條件下5 000 r/min離心10 min。收集上清液。重復(fù)以上操作，合并兩次上清液A，用精密試管記錄體積，一部分上清液A（留出2次備用體積）用3 mol/l的K2CO3和0.5 mol/l三乙醇胺混合液中和（pH值7.5），然后5 000 r/min離心10 min，收集上清液C。上清液C用0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.2.5 酶解處理

處理后樣品中按順序分別加入乙酰CoA（0.000 1 mol/l）25 μl，磷酸緩沖液（0.01 mol/l）300 μl，EDTA（0.001 mol/l)100 μl，CAT(1.3 U)20 μl(空白試驗(yàn))加入KH2PO4（0.01 mol/l）20 μl，2-巰基乙醇（0.01 mol/l）55 μl，進(jìn)行酶反應(yīng)試驗(yàn)和空白試驗(yàn)，反應(yīng)混合物在25 ℃培養(yǎng)30 min，加入0.1 ml磷酸（11 mol/l）終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用0.45 μm濾膜過濾，記錄體積。用HPLC測定魚肉中肉堿含量[8]。

1.2.6 HPLC色譜條件

色譜柱:Cosmosil 5C18-AR(4.6 mm×250 mm);紫外檢測波長254 nm；流動(dòng)相:KH2PO4(0.190 mol/l)∶meth?anol(甲醇)=80.5∶19.5(v/v)；流速：0.7 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；分析時(shí)間：初設(shè)為15～20 min。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及游離肉堿含量計(jì)算

精密稱取L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，加流動(dòng)相配制成0、20、40、60、80、100 μg/ml的梯度溶液，進(jìn)行酶反應(yīng)試驗(yàn)和空白試驗(yàn)，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，以出現(xiàn)的CoASH峰面積為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算R值，寫出曲線方程為：Y=aX+b，根據(jù)設(shè)定的濃度和對應(yīng)的峰面積計(jì)算出a、b值。

式中：Y——代表曲線的濃度；

X——對應(yīng)濃度的峰面積。

樣品提取液和L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線分別按設(shè)定的色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)兩種溶液峰面積值計(jì)算樣品中L-肉堿的含量（mg/g），公式如下：

式中：Ci——樣品中L-肉堿的含量（mg/g）；

Cs——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的L-肉堿濃度(mg/ml);

V——樣品提取液總體積（ml）；

m——樣品質(zhì)量（g）；

161.2——肉堿分子量。

1.3 儀器和設(shè)備

LC-2010高效液相色譜儀，AUY220電子天平（感量 0.000 1 g）（日本島津）；色譜柱Cosmosil5C18-AR 4.6×250 mm（上海生工）；SONICS細(xì)胞破碎儀(USA)；水平振蕩器、離心機(jī)（德國艾本德）；單道可調(diào)移液器（德國EPPENDORF公司）；自動(dòng)顆粒制冰機(jī)（江蘇太倉華美生化儀器廠）；GM-0.33隔膜真空泵（天津市騰達(dá)過濾器）；DK-8D電熱恒溫水?。ㄉ虾＞軐?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；pH酸度計(jì)DELTA320（梅特勒）；飼料膨化機(jī)DGP-010II（河北裕工）；2.2 kW絞肉機(jī)（河北）；HD-25型轉(zhuǎn)鼓式添加劑混合機(jī)，自制圓筒型篩網(wǎng)，粉碎機(jī)JFSD-100III（上海嘉實(shí)）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表中所有試驗(yàn)結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=3)。采用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)處理組之間存在顯著性差異(P＜0.05)時(shí)，用Duncan's法進(jìn)行多重比較分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0軟件和Excel 2003進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗(yàn)選擇了0、20、40、60、80、100 μmol/l 6個(gè)肉堿標(biāo)準(zhǔn)濃度，上機(jī)測定后得到其峰面積（見表3）。以峰面積差為縱坐標(biāo)，肉堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

表3 不同濃度肉堿標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的峰面積差

圖1 肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 浸泡時(shí)間對飼料中游離肉堿含量的影響

不同的浸泡時(shí)間對飼料中L-肉堿的影響情況見圖2。由圖2可知，添加L-肉堿的鯉魚飼料在水中浸泡的時(shí)間不同，其所含的L-肉堿數(shù)量不同。隨著浸泡時(shí)間（0～60 min）的不斷增加，浸泡過后的鯉魚飼料中L-肉堿濃度（1.83～0.87 μmol/g）呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。其中浸泡60 min組飼料的L-肉堿含量最低(0.87 μmol/g)，其次是浸泡30 min組飼料(0.99 μmol/g)，浸泡10 min組飼料（1.44 μmol/g）。與對照組相比，浸泡10 min組飼料、浸泡30 min組飼料和浸泡60 min組飼料的L-肉堿含量均顯著降低（P＜0.05），而10 min組飼料中L-肉堿含量顯著高于浸泡30 min組飼料和浸泡60 min組飼料的L-肉堿含量（P＜0.05），浸泡30 min組飼料中L-肉堿含量顯著高于浸泡60 min組(P＜0.05)。

圖2 浸泡時(shí)間對添加肉堿的鯉魚飼料中肉堿含量的影響

2.3 不同水煮時(shí)間對6種不同食性魚類肌肉中肉堿含量的影響

取草魚、鯉魚、白鰱、鯰魚、虹鱒和鱖魚的背大肌，分別水煮5、15、30 min。按照1.2.6中的 HPLC色譜條件得到肉堿出峰時(shí)間和峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算肉堿含量（見表4）。由表4可見，不同水煮時(shí)間對前5種魚背大肌中L-肉堿含量均有明顯的影響，而對鱖魚無明顯影響；同時(shí)可知不同水煮時(shí)間對不同魚類背肌中L-肉堿含量的影響存在差異，但趨勢均是隨著水煮時(shí)間的增加含量逐漸減小。

表4 不同的水煮時(shí)間對6種魚背大肌肉堿含量的影響(μmol/g)

2.4 不同水煮段內(nèi)6種不同食性魚類肌肉中游離L-肉堿溶失的平均速率的變化

本研究中，6種不同食性魚類肌肉中游離L-肉堿溶失的平均速率在不同的水煮時(shí)間段內(nèi)變化趨勢見圖3。由圖3可知，在30 min的水煮時(shí)間內(nèi)，三個(gè)時(shí)間段內(nèi)，魚背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率的變化情況并不完全相同。分析可知，6種不同食性魚背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率的變化趨勢可分為三種，一種是先升高后降低，如鯰魚、白鰱；另一種是逐漸降低，如鯉魚、草魚、鱖魚；還有一種是先降低后升高，如虹鱒。

圖3 不同水煮時(shí)間段內(nèi)6種不同食性魚類肌肉中游離L-肉堿溶失的平均速率變化趨勢

3 討論

自從肉堿被第一次發(fā)現(xiàn)（1905年）至今已有100多年的歷史，其基本的生理功能為促進(jìn)機(jī)體脂肪酸代謝，加速細(xì)胞基質(zhì)中脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化，為機(jī)體提供更多能量。同時(shí)，肉堿還是孕婦、新生嬰兒的必需營養(yǎng)物質(zhì)，對老年人心臟病、心血管疾病等也能起到預(yù)防作用。因此不僅對于這些特殊人群（孕婦、嬰兒、老年人、運(yùn)動(dòng)員、肥胖者、病人等），肉堿是一種必需的營養(yǎng)素，就是對于正常人群，滿足體內(nèi)肉堿的需要對健康是非常有意義的。人體內(nèi)肉堿來源于兩個(gè)途徑，一個(gè)途徑是體內(nèi)自身的合成，另一個(gè)途徑是從食物中攝取。Ilhami Gulcin（2006）[9]發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)肉堿有25%來源于體內(nèi)合成，75%來源于食物當(dāng)中。在日常的飲食中，各種食物肉堿的含量不盡相同。Sheenan Harpaz[10]研究報(bào)道，鮮肉類食品肉堿最高（500～1 200 mg/kg），其次是魚類，再是雞肉和奶制品（16～64 mg/kg），而蔬菜、水果等植物性食品中肉堿含量最少（＜0.5 mg/kg）。由此可知，魚類是一種在日常飲食當(dāng)中肉堿含量較高的來源，合理的烹飪調(diào)質(zhì)，最大可能地吸收魚類當(dāng)中的肉堿具有重要意義。

本研究結(jié)果表明,游離L-肉堿水平依次為濾食性的白鰱(2.06 μmol/g)最高，草食性的草魚(1.36 μmol/g)次之，其次是肉食性魚虹鱒(1.27 μmol/g)、鱖魚(1.04 μmol/g)、鯰魚（0.81 μmol/g），最少的是雜食性鯉魚（0.73 μmol/g）。這一試驗(yàn)結(jié)果與理論上推斷存在差異，原因可能有以下兩方面：第一，魚肌肉中L-肉堿的存在形式有兩種，一種是游離型L-肉堿，另一種是酯化型L-肉堿，兩者之和稱之為總的L-肉堿含量。本試驗(yàn)所測得的只是游離型L-肉堿濃度，酯化型L-肉堿濃度未測得，所以推測肉食性魚背肌中L-肉堿更多的是以酯化型L-肉堿的形式存在，而濾食性魚和草食性魚背肌中L-肉堿更多的是以游離型L-肉堿的形式存在。第二，試驗(yàn)魚的年齡、飼料（L-肉堿水平）、飼養(yǎng)環(huán)境等均會不同程度地影響L-肉堿在機(jī)體內(nèi)的沉積，而本試驗(yàn)所用的試驗(yàn)魚均是購于市場，其詳細(xì)情況并不清楚，這也可能是造成這一結(jié)果的原因。

Caroline Rigault等[11]研究了不同的家庭烹飪方式對鮭魚中肉堿含量（包括游離肉堿）的影響，結(jié)果顯示：除了熏制處理會顯著降低鮭魚的肉堿水平，其它處理（煎炸5 min、水煮5 min、燒烤10 min、烘烤10 min、微波爐加熱2 min、蒸煮5 min、冷凍保存1～6月）均未顯著降低鮭魚肉堿水平，其中熏制處理造成肉堿顯著降低，其中游離肉堿濃度幾乎未變，這說明熏制處理使酯化型肉堿降低，多游離型肉堿并未造成影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，草魚、白鰱、鱖魚、虹鱒4種魚在水煮5 min時(shí)，肌肉中肉堿濃度均未顯著降低，與Caroline Rigault等[11]研究結(jié)果一致。

按照中國人的飲食習(xí)慣，通常情況下均是將生魚經(jīng)過高溫處理后才會食用，例如，煎炸、煲湯、熏制等加工處理，而肉堿是一種極易溶于水的類似維生素的營養(yǎng)物質(zhì)，魚肌肉中肉堿在水煮處理?xiàng)l件下，隨著肌肉細(xì)胞被破壞而游離出細(xì)胞溶解在水中。這是否會對魚類中肉堿造成損失，相關(guān)的報(bào)道較少。本研究設(shè)置了5、15、30 min的水煮時(shí)間，探討水煮處理對魚肉中肉堿含量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，水煮處理會造成魚肌肉中肉堿含量不同程度的減少。在試驗(yàn)期間，水煮時(shí)間對鱖魚中肉堿無顯著影響，其余5種魚類均有顯著影響。鯉魚和鯰魚在水煮5 min時(shí)肌肉中肉堿含量就顯著降低，而草魚是在水煮15 min時(shí)才顯著降低，白鰱和虹鱒是在水煮30 min時(shí)肌肉中肉堿含量才顯著降低。由此可知，不同食性的魚背肌中游離L-肉堿在相同的水煮時(shí)間條件下溶失的平均速率不同，在水煮0～5 min時(shí)間內(nèi)，鯉魚背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率最大；在水煮5～15 min內(nèi)，白鰱背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率最大；在水煮15～30 min內(nèi)，虹鱒背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率最大。通過對比可知，在水煮30 min內(nèi)，6種不同食性魚背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率的變化趨勢可分為三種，一種是先升高后降低，如鯰魚、白鰱；另一種是逐漸降低，如鯉魚、草魚、鱖魚；還有一種是先降低后升高，如虹鱒。造成這一結(jié)果的主要原因可能是由于魚種類所致，不同種類的魚，其背肌肌纖維結(jié)構(gòu)可能存在，對溫度的敏感程度也不同，所以導(dǎo)致不同食性魚在相同的水煮處理?xiàng)l件下，其背肌中游離L-肉堿溶失的平均速率存在差異。

在水煮30 min條件下，未檢測到鯉魚背肌中肉堿水平，這可能是由于水煮15 min時(shí)，鯉魚肌肉中游離L-肉堿已經(jīng)降低了88%，又經(jīng)過15 min的水煮處理，肌肉中剩余的12%肉堿全部溶于水中，所以未能檢測出水煮30 min時(shí)鯉魚背肌肉堿的含量。水煮處理（0～30 min）鱖魚背肌中游離L-肉堿含量未顯著降低，產(chǎn)生這一現(xiàn)象原因可能是鱖魚背肌細(xì)胞對水煮處理不敏感，而更有可能的原因是，鱖魚背肌中L-肉堿更多的是以酯化型肉堿形式存在的。至于水煮加熱處理對不同食性魚肌肉中L-肉堿溶失規(guī)律的機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

水產(chǎn)動(dòng)物其攝食方式有別于畜禽，其生活的環(huán)境是在水體中，飼料必須要投入到水中才能被水產(chǎn)動(dòng)物所攝食，而且投入水體的部分顆粒飼料不能及時(shí)被水產(chǎn)動(dòng)物攝食，需要在水中浸泡一段時(shí)間才能被動(dòng)物攝食。正是由于這些方面的差別就要求水產(chǎn)顆粒飼料在水中能保持一定穩(wěn)定性，即飼料經(jīng)投喂后在水中受到水流的沖擊和浸泡，能再一定時(shí)間內(nèi)保持飼料組分不被溶解及飼料不散失的性能。適量的肉堿添加能提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益，但是肉堿是一種易溶于水、易吸潮的物質(zhì)，它的溶解性導(dǎo)致飼料中肉堿勢必要有一定程度的溶失。本試驗(yàn)結(jié)果表明：在浸泡0～10 min時(shí)間范圍內(nèi)，飼料中肉堿含量減少了21.31%，而在10～30 min這20 min的浸泡時(shí)間內(nèi)，飼料中肉堿含量減少了24.59%，在30～60 min這30 min的浸泡時(shí)間內(nèi)，飼料中的肉堿減少了6.56%。這說明，鯉魚飼料中肉堿的溶失主要集中在浸泡水中前30 min，期間肉堿溶于水體中的量為45.90%。飼料在水中浸泡超過30 min后，肉堿溶解相對減少。

通過對以上數(shù)據(jù)的分析可知，鯉魚飼料中肉堿含量在投入水中30 min內(nèi)減少較大，尤其是在水中浸泡的前10 min，飼料中肉堿溶失最快。朱伯清等[12]試驗(yàn)結(jié)果表明，顆粒飼料在水中浸泡的穩(wěn)定性一般不超過30 min時(shí)，水中飼料損失率可達(dá)40%以上。通常蝦、蟹的攝食時(shí)間是在投料后約2 h可攝食完全；而魚類的攝食時(shí)間是在20～30 min內(nèi)，甚至有些魚類投料15 s內(nèi)即可攝食完全。所以筆者建議，在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)踐過程中，應(yīng)該采用少量多次的投喂方式。因?yàn)槿绻淮涡酝度胼^多的飼料而不能全部被魚類所攝食，剩余的飼料勢必就要在水中浸泡一段時(shí)間才能被采食，飼料在水中浸泡的時(shí)間內(nèi)必將引起飼料中肉堿水平的降低，從而減少了水產(chǎn)動(dòng)物攝食肉堿的含量，降低了魚類的生長性能和抗應(yīng)激能力，影響了魚類的健康生長，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失。陳四清等[5]研究表明，如缺乏水溶性維生素類營養(yǎng)物質(zhì)，則會引起魚、蝦蛋白質(zhì)的消化吸收，長期缺乏則會引起抵抗力下降、組織出血、甚至死亡等癥狀?？偠灾?，準(zhǔn)確的控制投飼技術(shù)比較重要，投飼技術(shù)是保證飼料中肉堿不被浪費(fèi)的關(guān)鍵。

浸泡時(shí)間是飼料中肉堿含量溶失的主要因素，而肉堿溶失的速率還與飼料本身的物理性質(zhì)有一定的關(guān)系。如飼料的穩(wěn)定性，而飼料的穩(wěn)定性又是由諸多因素所決定的，如：黏合劑的使用，飼料加工技術(shù)與工藝，原料本身的性質(zhì)等。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，水煮處理對白鰱、草魚、虹鱒、鯰魚、鯉魚5種魚背肌中游離L-肉堿含量均顯著降低，對鱖魚魚背肌中游離L-肉堿含量無明顯影響；不同食性的魚背肌中游離L-肉堿溶失速率變化趨勢不同。隨著浸泡時(shí)間的不斷增加，鯉魚飼料（添加200 mg/kg L-肉堿）中游離肉堿含量逐漸減少，在浸泡前30 min內(nèi)，飼料中肉堿溶失量最大。