任志國

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，山東臨沂276004)

鐵皮石斛是蘭科石斛蘭屬多年生草本植物［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其有主傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸胃的功效［2，3］。多項(xiàng)研究已證實(shí)，鐵皮石斛中的石斛多糖具有明顯抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、促消化、抗疲勞和抑菌等［4］作用。B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤占全部淋巴瘤病例的68%［1］。近年來，多種治療方法和藥物，如化療、自體造血干細(xì)胞移植、放療、干擾素等，被用于治療B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤［2］，但腫瘤緩解率及患者生存率都不理想。2013年6～12月，我們觀察了石斛多糖對人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 鐵皮石斛由連城鐵皮石斛生物制藥組培基地惠贈(zèng)，人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海七海生物科技有限公司;RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司;MTT購自Sigma公司，RPMI1640、胎牛血清等購自Gbico公司。引物由上海賽百盛生物公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 石斛多糖的提取與制備 鐵皮石斛充分干燥后打成細(xì)粉，稱取200 g鐵皮石斛細(xì)粉，60℃石油醚回流脫脂，取殘?jiān)鼡]干溶劑后，80%乙醇回流后揮干溶劑。布氏漏斗抽濾提取液和洗滌液得到濃縮液，Sevag法脫蛋白［5］。取上層液體，以1:4比例加入乙醇沉淀后，抽濾干燥，即得石斛多糖。硫酸蒽酮比色法測定糖含量為82.34%。稱取石斛多糖，溶于生理鹽水配成適當(dāng)濃度，過濾除菌備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 10%胎牛血清1640培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素)，37℃，5%CO2培養(yǎng)人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株，每2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于 96孔板(90 μL/孔，1×105個(gè)/mL)。設(shè)對照組和A、B、C、D組共5組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔及調(diào)零孔。培養(yǎng)12 h后分別加入0、100、200、400、800 mg/L 的石斛多糖溶液，10 μL/孔。

1.2.3 Raji細(xì)胞增殖抑制率的測算 采用 MTT法。各組Raji細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后各觀察細(xì)胞形態(tài)1次，培養(yǎng)72 h后加入 MTT(5 mg/mL，20 μL/孔)，4 h后每孔加入酸化的 SDS溶液100 μL，12 h后測定 OD490。用下列公式計(jì)算 A、B、C、D組 Raji細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組OD490－實(shí)驗(yàn)組OD490)/對照組OD490×100%。

1.2.4 Raji細(xì)胞凋亡率的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。各組Raji細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h后1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min 收集細(xì)胞，Binding Buffer(400 μL/孔)重懸細(xì)胞，加入 Annexin V-FITC(5 μL/孔)，避光 15 min后加入10 μL PI染液0℃作用5 min，30 min內(nèi)測量對照組及A、B、C、D組Raji細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Raji細(xì)胞中Caspase-3 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。各組 Raji細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。設(shè)計(jì)引物:Caspase-3(365 bp)上 游:5'-TGACCGAGGCTACATTCAGATGA-CACC-3';下 游:5'-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3'。β-actin(243 bp):上游:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'， 下 游:5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。50 μL 反應(yīng) 體 系，擴(kuò)增條件:94℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 50 s，53℃45 s，72 ℃ 1 min)，72℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算相對表達(dá)量(與β-actin光密度值比值)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以±s表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石斛多糖對Raji細(xì)胞增殖的影響 各組Raji細(xì)胞增殖抑制率見表1。由表1可見，隨著石斛多糖濃度的提高和作用時(shí)間延長，各組Raji細(xì)胞增殖抑制率也升高，P均＜0.05。

表1 各組Raji細(xì)胞生長抑制率比較(±s)

表1 各組Raji細(xì)胞生長抑制率比較(±s)

組別 n Raji細(xì)胞增殖抑制率(%)A組8培養(yǎng)24 h 9.81 ±1.67培養(yǎng)48 h 49.52 ±7.37培養(yǎng)72 h 58.80 ±2.71 B組 8培養(yǎng)24 h 12.78 ±3.32培養(yǎng)48 h 63.43 ±3.29培養(yǎng)72 h 72.51 ±1.64 C組 8培養(yǎng)24 h 14.96 ±1.28培養(yǎng)48 h 73.34 ±1.36培養(yǎng)72 h 79.86 ±5.63 D組 8培養(yǎng)24 h 21.11 ±5.66培養(yǎng)48 h 79.51 ±3.56培養(yǎng)72 h 90.60 ±7.10

2.2 各組Raji細(xì)胞凋亡率 各組Raji細(xì)胞凋亡率見表2。由表2可見，隨著石斛多糖濃度的提高和作用時(shí)間延長，各組Raji細(xì)胞凋亡率也升高，P均＜0.05。

2.3 Raji細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)情況 石斛多糖作用Raji細(xì)胞48 h后各組細(xì)胞Caspase-3相對表達(dá)量分別為對照組0.498±0.054、A 組0.717 ±0.074、B 組 0.837 ±0.048、C 組0.985 ±0.087、D 組1.121±0.058。隨著石斛多糖濃度增加，Caspase-3 mRNA表達(dá)量逐漸增高，P均＜0.05。

3 討論

多糖是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類大分子物質(zhì)，是生命物質(zhì)的重要組成成分之一，并且廣泛的參與各種生命活動(dòng)［6］。研究表明，多糖類物質(zhì)在提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、降低血糖血脂和抗衰老等方面具有重要作用，且越來越多的生物活性多糖已被提取且用于臨床［7］。鄧鵬等［8］報(bào)道多糖具有人鼻咽癌細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的作用。金樂紅等［9］在研究中發(fā)現(xiàn)，石斛多糖可以有效抑制小鼠肉瘤和離體肝腫瘤細(xì)胞的生長。在血液系統(tǒng)腫瘤治療方面，鄭斯卓等［10］指出石斛多糖可通過抑制BCR-ABL融合基因的表達(dá)，誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。但石斛多糖對人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞的作用及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。

表2 各組Raji細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率比較 (±s)

表2 各組Raji細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率比較 (±s)

組別 n Raji細(xì)胞凋亡抑制率(%)對照組8培養(yǎng)48 h 14.12 ±0.57培養(yǎng)72 h 13.97 ±0.37 A組 8培養(yǎng)48 h 15.87 ±0.74培養(yǎng)72 h 19.78 ±0.47 B組 8培養(yǎng)48 h 27.45 ±1.12培養(yǎng)72 h 48.50 ±1.04 C組 8培養(yǎng)48 h 37.87 ±1.45培養(yǎng)72 h 54.75 ±1.54 D組 8培養(yǎng)48 h 43.57 ±1.47培養(yǎng)72 h 53.87 ±0.97

本研究通過水提醇沉淀法從鐵皮石斛中提取石斛多糖，體外培養(yǎng)人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞，將不同濃度石斛多糖作用于 Raji細(xì)胞24、48、72 h，MTT法檢測石斛多糖對Raji細(xì)胞增殖的影響，在100、200、400、800mg/L濃度時(shí)石斛多糖對Raji細(xì)胞均具有抑制作用，隨著石斛多糖濃度的提高，細(xì)胞生長抑制率也升高(P＜0.05)。同時(shí)對石斛多糖濃度為100、200、400、800mg/L 時(shí)，3 個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞生長抑制率進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示石斛多糖可以抑制Raji細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且效果隨著作用劑量和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3參與細(xì)胞生理及病理性死亡過程，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者［11］，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡受阻［12］。已有文獻(xiàn)報(bào)道許多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與Caspase-3的表達(dá)有關(guān)［13］。本研究采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示隨著石斛多糖濃度升高，Caspase-3 mRNA表達(dá)量逐漸升高，表明石斛多糖可促進(jìn)Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而使Raji細(xì)胞發(fā)生凋亡，是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一。

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