劉彥魁，游慶軍，金琳芳，馮靜潔，齊曉薇

(無錫市第四人民醫(yī)院，江蘇無錫214062)

淋巴轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的主要方式。瘤細胞浸入淋巴管后，隨淋巴流首先到達局部引流淋巴結(jié)，之后聚集于邊緣竇，繼續(xù)增殖累及整個淋巴結(jié)。結(jié)直腸癌伴淋巴轉(zhuǎn)移者預(yù)后明顯不良，且對放化療敏感性低［1～3］。CXCL13是趨化因子 CXC 家族的一員，主要分布在人體肝臟、淋巴結(jié)和血清中，其編碼基因定位于 4q21［4，5］。CXCL13 能夠吸附 B 細胞，并參與免疫系統(tǒng)信號的傳遞。CXCL13與其受體CXCR5共同作用發(fā)揮生物學效應(yīng)，后者主要分布在成熟B細胞上，參與免疫功能微環(huán)境的構(gòu)建，具有協(xié)調(diào)體液免疫的功能。最近研究表明，CXCL13及其受體CXCR5的表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有緊密的關(guān)系［6，7］。KRAS基因是結(jié)直腸癌的重要相關(guān)基因，已有分子靶向藥物絡(luò)氨酸激酶抑制劑用于臨床。結(jié)直腸癌組織中CXCL13表達是否與KRAS基因有關(guān)尚不清楚。2013年1～11月，我們觀察了CXCL13及其受體CXCR5對結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響，并探討其與KRAS基因突變的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 97例結(jié)直腸癌原發(fā)灶標本(觀察A組)和51例轉(zhuǎn)移灶標本(觀察B組)為2007～2009年間無錫市第四人民醫(yī)院手術(shù)切除標本，經(jīng)病理檢查確診;52例正常結(jié)直腸標本(對照A組)和43例正常淋巴結(jié)標本(對照B組)為2011～2012年該院手術(shù)切除標本，經(jīng)病理診斷為癌癥陰性者。觀察組結(jié)直腸癌患者中男63例，女85例;對照組男45例，女50例。兩組入選標本所涉及患者年齡36～77歲，中位年齡49歲。本研究涉及患者標本采集前均簽署知情同意書，手術(shù)前均未接受放化療及其他特殊藥物治療。觀察組結(jié)腸癌84例，直腸癌64例;管狀腺癌58例，乳頭狀腺癌52例，黏液癌31例，未分化癌7例。隨訪?個月，失訪11例，死亡41例，意外死亡4例。

1.2 CXCL13和CXCR5表達檢測及結(jié)果判定方法采用免疫組化法。CXCR5和CXCL13鼠抗人抗體購自美國R＆D Systems公司，DAB顯色劑購自基因科技上海有限公司。標本采集后立即浸入10%中性甲醛液中固定12 h，經(jīng)病理醫(yī)生取材后、脫水、透明、包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇除去二甲苯，高壓鍋修復(fù)，3%的正常羊血清封閉特異性位點20 min，接著用一抗孵育1 h，二抗孵育30 min，最后用DAB顯色。免疫組化結(jié)果由兩名副主任以上職稱醫(yī)師判讀得出。細胞膜和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色為CXCR5或CXCL13陽性。按著色強度評分:無著色得0分，弱陽性得1分，中等強度陽性得2分，強陽性得3分。按陽性細胞比例評分:無細胞著色得0分，陽性細胞比例1%～9%得0.1分，陽性細胞比例10%～49%的0.5分，陽性細胞比例大于50%得1分。最終結(jié)果H評分為著色強度評分和陽性細胞比例得分的乘積［6］。

1.3 KRAS基因突變情況檢測方法 KRAS基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。首先用FFPE DNA提取試劑盒提取石蠟包埋的原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶標本的DNA，然后采用Real Time PCR法檢測人類KRAS基因的突變，包括12和13密碼子上7種熱點體細胞的突變，分別為:Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys、Gly13Asp。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料的集中趨勢與離散趨勢以±s表示。各臨床病理參數(shù)與CXCL13和CXCR5表達的相關(guān)性分析采用四格表χ2或R×C列表χ2分析;組間生存分析數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用Kaplan-Meier's分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13及CXCR5表達 CXCL13主要表達于間質(zhì)細胞，觀察A組陽性表達率為36.08%，觀察B組47.06%，對照A組0，對照 B組11.63%。CXCL13陽性表達率觀察B組＞觀察A組＞對照B組＞對照A組，P均＜0.05。CXCR5主要表達于上皮細胞，觀察 A組陽性表達率 41.24%，觀察 B組49.01%，對照A組0，對照B組9.30%。CXCR5陽性表達率觀察B組＞觀察A組＞對照B組＞對照A組，P均＜0.05。觀察組CXCL13與CXCR5表達水平有相關(guān)性(P＜0.05)。

2.2 CXCL13及CXCR5蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白表達與TNM分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，與分化程度呈負相關(guān)(P＜0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤組織學分類等無明顯相關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白陽性表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CXCL13及CXCR5蛋白表達與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系 觀察B組CXCL13表達陽性者5年無進展中位生存時間(PFS)為(9.0±2.3)個月，陰性者為(12.0±7.3)個月，P ＜0.05;CXCR5表達陽性者5 年P(guān)FS為(11.4 ±5.4)個月，陰性者為(25.5 ±9.3)個月，P＜0.05。觀察A組CXCL13表達陽性者5年P(guān)FS為(25.0 ±11.3)個月，陰性者(37.0 ±16.5)個月，P＜0.05;CXCR5表達陽性者5年P(guān)FS為(21.7±4.8)個月，陰性者為(55.0 ±17.5)個月，P ＜0.05。

2.4 CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因突變的關(guān)系 觀察A組KRAS基因突變型36例(其中CXCL13表達陽性12例、CXCR5表達陽性17例)，野生型61例(其中CXCL13表達陽性23例、CXCR5表達陽性23例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關(guān)性(P均＜0.05)。觀察B組KRAS基因突變型20例(其中CXCL13表達陽性16例、CXCR5表達陽性14例)，野生型31例(其中CXCL13表達陽性8例、CXCR5表達陽性11例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關(guān)性(P均＜0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，居腫瘤發(fā)病率的第5位，且近年有逐漸增加的趨勢［8，9］。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移常作為評價預(yù)后的重要指標，轉(zhuǎn)移的程度對治療策略的選擇也有重要的意義。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，結(jié)腸癌在結(jié)腸上、旁、中間和終末四組淋巴結(jié)均有轉(zhuǎn)移;直腸癌首先轉(zhuǎn)移至直腸旁淋巴結(jié)，然后再擴散，浸及直腸及肛周組織［3，10］。近年發(fā)現(xiàn)一系列與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要關(guān)系的小分子調(diào)節(jié)蛋白，趨化因子就是其中重要的一類。趨化因子通過與其受體相互作用發(fā)揮重要的生物學功能。

趨化因子主要有C、CC、CXC、CX3C四個家族，其主要與機體的免疫系統(tǒng)相關(guān)。最早發(fā)現(xiàn)其與HIV病毒感染的機制有一定的關(guān)系［11，12］。近年研究發(fā)現(xiàn)，其與多種腫瘤的進展有一定的關(guān)系，尤其是CXCL13及其受體蛋白CXCR5的表達。CXCL13是CXC家族的一種，研究者最先在肝臟和淋巴結(jié)中檢測到其表達。Burkle等［13］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5在慢性淋巴細胞白血病病情的進展中發(fā)揮重要作用。CXCLl3和CXCR5的表達與HIV感染過程中B細胞機能障礙的形成有關(guān)。張巖等［14］檢測到其在胸腺瘤合并重癥肌無力的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，CXCL13及其受體CXCR5的表達更易引起上述疾病的發(fā)生。易誠青等［15］發(fā)現(xiàn)CXCL13和CXCR5與成骨活躍程度相關(guān)，并表現(xiàn)為明顯的時間與位點特征。鄒春華等［16］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5的表達與肺癌組織學類型密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌組織學類型和復(fù)發(fā)有一定關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，CXCL13在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達高于原發(fā)灶，在正常的結(jié)直腸組織中未檢測到其表達。CXCL13在轉(zhuǎn)移灶淋巴結(jié)中的表達明顯高于正常淋巴結(jié)。CXCR5的表達與CXCL13具有相似的特征。由此可以看出，CXCL13及其受體蛋白CXCR5可以作為評估結(jié)直腸癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的新的指標。但是關(guān)于CXCL13及CXCR5在結(jié)直腸癌發(fā)病中的具體作用機制，仍需要進一步研究。通過觀察CXCL13及CXCR5的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)CXCL13及CXCR5的表達與結(jié)直腸癌的TNM分期和腫瘤的分化程度具有相關(guān)性。腫瘤的TNM分期越高，越容易檢測到CXCR5的表達;腫瘤的分化程度越低，越易檢測到CXCL13及CXCR5的表達。后者與曹寶森等［4］研究發(fā)現(xiàn)的CXCL13及CXCR5在非小細胞肺癌中的表達特點具有一定的相似性。

結(jié)合隨訪資料分析發(fā)現(xiàn)，無論是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，在有CXCL13及其受體蛋白CXCR5表達組中，其無進展生存期均短于CXCL13及CXCR5無表達者。可以看出，CXCL13及其受體蛋白CXCR5的表達，是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的一個標志。這與Razis等［17］研究發(fā)現(xiàn) CXCL13及 CXCR5的表達對 Her2陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響是一致的，然而對于Her2陽性的乳腺癌患者，CXCL13及CXCR5的表達卻是一個有利的預(yù)后因子。CXCL13及CXCR5如何與Her2基因發(fā)生相互作用以及其具體作用的機制，有待進一步研究。

KRAS基因是RAS基因家族的一種，定位于第12號染色上。在RAS基因家族中，KRAS對人類癌癥影響最大，它能控制調(diào)控細胞生長的信號通路;其發(fā)生異常時，則導(dǎo)致細胞持續(xù)生長，并阻止細胞自我毀滅。它參與細胞內(nèi)的信號傳遞，若KRAS基因發(fā)生突變，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，使細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，細胞增殖失控而癌變［18～20］。當前研究其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有較為明顯的關(guān)系，尤其是對結(jié)直腸癌的預(yù)后有較為明顯的關(guān)系。在KRAS未發(fā)生突變的情況下，使用分子靶向藥物帕尼單抗治療結(jié)直腸癌患者取得了較好的治療效果［21，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13 及其受體蛋白CXCR5的表達與KRAS基因的突變具有一定的相關(guān)性，我們推測CXCL13及CXCR5與KRAS基因的信號傳遞有一點關(guān)聯(lián)，其具體影響機制有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，趨化因子CXCL13及CXCR5蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中的表達高于其原發(fā)灶，提示其與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)，其具體作用機制有待進一步探索。CXCL13及CXCR5蛋白表達陽性的結(jié)直腸癌患者其無進展生存期明顯低于CXCL13及 CXCR5陰性表達患者，提示 CXCL13及CXCR5是結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后因子，其具體機制有待進一步研究。CXCL13及CXCR5的表達與KRAS基因的突變有一定的相關(guān)性，CXCL13及CXCR5表達的患者中KRAS基因突變發(fā)生率較高，提示CXCL13及CXCR5可能參與KRAS基因信號的傳遞，其具體影響機制尚需深入探討。

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