王春偉，洪潔赟，張衛(wèi)藝，呂 妍，郭秋平，趙 軍，胡建宏

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

睪丸組織的冷凍保存尤其是幼齡動物睪丸組織的冷凍保存為雄性動物生殖細胞的保存、珍稀瀕危物種的保護以及人類輔助生殖等提供了新的途徑［1］。冷凍睪丸組織能夠避免酶解造成細胞存活率降低，機械分離破壞細胞間連接，造成細胞缺氧加重等影響［2］。由于人們對幼齡動物睪丸冷凍的機理還不甚清楚，冷凍－解凍后睪丸組織活性的變化、精原干細胞微生境的恢復能力以及影響睪丸組織冷凍效果的關鍵因素等仍處于探索階段［3－4］。盡管如此，目前國內(nèi)外已經(jīng)開展了幼齡動物睪丸組織冷凍方面的研究。在國內(nèi)，李蓮軍等［5］研究表明，完整小鼠睪丸冷凍后細胞復蘇率低于60%，但精原干細胞能夠正常貼壁、生長和分裂；王曉英［6］利用不同冷凍保護劑冷凍未成熟小鼠睪丸組織，結果發(fā)現(xiàn)（Dimethyl sulfoxide，DMSO）組未受損的精原細胞為71%，甘油（GLY）組為57%。朱海鯨等［7］研究表明，DMSO 和乙二醇對羊睪丸組織具有良好的冷凍保護作用，經(jīng)5%～10% DMSO 冷凍保存后，羊睪丸組織總細胞活率高達65.87%。李淼等［8］研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化方法凍存睪丸組織，睪丸組織特異性基因TESK1 和pgk－2表達均正常，組織形態(tài)改變較小。在國外，Avarbock等［9］首次報道，精原干細胞用常規(guī)冷凍方法長期保存后能夠保持增殖和分化能力，解凍后睪丸組織中大約1／3的細胞復活；Yildiz等［10］檢測了冷凍前后睪丸組織中精子發(fā)生和睪酮的生成，結果表明經(jīng)DMSO 冷凍保存睪丸組織后，獲得46.6%的組織存活率以及最高的睪酮水平；Paweena等［11］分析了冷凍對睪丸精子質膜和DNA以及曲細精管的損傷，質膜完整率減少了13.0%，DNA完整率減少了6.6%?？v觀國內(nèi)外的研究，目前對睪丸組織冷凍效果的評價主要側重在于對冷凍前后組織形態(tài)學變化，而對睪丸組織的生化指標的研究尚沒有相關報道。另外，目前對睪丸組織冷凍保存的研究主要集中在小鼠等實驗動物，而關于家畜尤其是牛睪丸組織的冷凍保存未見報道。

在冷凍保存過程中，睪丸組織會產(chǎn)生一定量的自由基，當自由基的產(chǎn)生超出自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，其毒性作用會影響睪丸的生精能力。一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）廣泛存在于哺乳動物的生殖系統(tǒng)內(nèi)，NO 是一種不穩(wěn)定信使小分子，具有很強的自由基氧化特征，NOS 能催化L－精氨酸合成NO［12］。鄭航等［13］研究表明，大鼠睪丸組織中NO和NOS的升高是生殖細胞凋亡增加的生化機制，對各種生殖活動起重要作用；Aksoy 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，過量NO 會導致動物生精障礙，造成導致不育。由此可知，NO 水平和NOS活性的變化能夠反映冷凍保護劑對睪丸組織的保護效果，以及睪丸組織的冷凍損傷程度和睪丸生精能力，但有關家畜睪丸組織冷凍前后NO 水平和NOS活性的變化未見報道。

關于動物睪丸組織的冷凍保存，目前多數(shù)研究集中在滲透性冷凍保護劑對睪丸組織的冷凍效果，而非滲透性冷凍保護劑的冷凍效果未見報道，且冷凍對睪丸活性的影響機理仍不清楚。本研究通過在基礎細胞培養(yǎng)液中添加DMSO、甘油、丙二醇、蔗糖和葡萄籽原花青素等不同冷凍保護劑，分析冷凍復蘇后犢牛睪丸細胞的存活率以及睪丸組織NO 和NOS的活性，揭示影響睪丸組織冷凍效果的關鍵因素，旨在初步建立犢牛睪丸組織低損傷冷凍保存體系。為人類未成年男性腫瘤患者、不育癥患者生育能力的恢復、動物精子發(fā)生機理、人類及動物復雜組織和器官的冷凍保存、珍稀瀕危物種的保護、轉基因動物研究以及人類某些遺傳病的基因治療等提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 犢牛睪丸的獲取

無菌條件下取出5～8月齡的秦川牛犢牛雙側睪丸，置于37℃含有雙抗的PBS的保溫杯中，在60 min內(nèi)帶回實驗室。用酒精棉球擦洗睪丸表面，經(jīng)過PBS 洗滌3 次，去除白膜后將睪丸剪碎切成1mm3大小的組織塊。

1.2 冷凍保護液的配制

依次選用5種冷凍保護劑（表1），包括3 種滲透性冷凍保護劑（DMSO、GLY 和PG）和2種非滲透性冷凍保護劑（Sucrose和GSP），其中非滲透性冷凍保護劑Sucrose母液濃度為0.4g／mL（即40g Sucrose溶于100 mL PBS 中），GSP 母液濃度為0.01g／mL（即1g GSP溶于100mL PBS中）。

表1 犢牛睪丸組織冷凍保護劑配方Table 1 Components of cryoprotectants prescriptions of calf testicular tissue

1.3 睪丸組織的冷凍與解凍

將2mL剪碎的犢牛睪丸組織與2mL 不同冷凍保護劑按照1∶1的體積比裝入5mL 凍存管中，震蕩混勻，在4 ℃平衡30min后，置于－20 ℃冷凍30min，然后置于－80 ℃冷凍12h，最后投入液氮中保存。7d后從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37 ℃的水浴鍋中復溫，直至睪丸組織全部融化。

1.4 睪丸組織勻漿液的制備

將復蘇后的組織塊轉移至離心管中，1 000rpm離心5min后棄掉冷凍保護劑，用PBS 洗滌3 次。在1mL睪丸組織中加入4 mL DMEM，將其研磨制備成20%的組織勻漿液，2 500rpm、4 ℃離心10 min取上清液并分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞懸液的制備

將復蘇后的睪丸組織用IV 型膠原酶和胰蛋白酶兩步法消化成單細胞懸液。

1.6 凍存效果評價

1.6.1 細胞活率 采用臺盼藍拒染法測定細胞活率。將單細胞懸液稀釋至106細胞／mL，細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合混勻。經(jīng)臺盼藍染色后，立刻在倒置顯微鏡下計數(shù)染成藍色及不染色細胞，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染?；罴毎剩?）＝活細胞總數(shù)／（活細胞總數(shù)＋死細胞總數(shù)）×100%。

1.6.2 NO 和NOS測定 按照南京建成生物公司提供的試劑盒說明書測定。

1.7 統(tǒng)計學處理

每個試驗處理重復3次，所有結果均用平均值±標準差（ˉx±SD）表示。利用SPSS軟件17.0，采用雙因素方差分析和Duncan法進行多重比較，對NO、NOS和細胞活率進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同冷凍保護劑對冷凍－解凍后睪丸組織細胞活率的影響

不同冷凍保護劑對冷凍－解凍后睪丸組織細胞活率的影響見表2。由表2知，DMSO 濃度為10%時，解凍復蘇后睪丸細胞活率最高，顯著優(yōu)于其他濃度（P＜0.05），達到77%；在濃度為10%時，DMSO、PG、Sucrose和GSP 冷凍保存睪丸組織后，解凍復蘇后睪丸細胞活率在組內(nèi)分別達到最高，而10%DMSO 顯著優(yōu)于其他組（P＜0.05）。含有7.5% GLY 的冷凍保護劑在組織解凍后，細胞活率在組內(nèi)最高達到41%，顯著高于組內(nèi)其他濃度（P＜0.05）但小于DMSO 和PG 組。因此，10% DMSO是冷凍睪丸組織最佳冷凍保護劑。

表2 不同冷凍保護劑對睪丸細胞活率的影響Table 2 Effects of different cryoprotectants on testicular cells rate

2.2 不同冷凍保護劑對睪丸組織中NO 的影響

不同冷凍保護劑對睪丸組織中NO 的影響見表3。由表3知，10% GSP 冷凍睪丸組織后NO 含量為0.49μmol／mgprot，顯著低于其他組（P＜0.05）；當濃度為10%時，DMSO、PG、Sucrose 和GSP 的NO 水平顯著低于組內(nèi)其他濃度（P＜0.05）；10%DMSO 組與10%PG 組之間差異不顯著（P＞0.05）；7.5% GLY 冷凍睪丸組織后NO 含量為0.54μmol／mgprot，顯著低于組內(nèi)其他濃度（P＜0.05）。表明10% GSP抑制NO 水平能力最強。

表3 不同冷凍保護劑對睪丸組織中NO 的影響Table 3 Effects of different cryoprotectants on nitric oxide of testicular tissue

2.3 不同冷凍保護劑對睪丸組織中NOS的影響

不同冷凍保護劑對睪丸組織中NOS的影響見表4。表4顯示，濃度為10%時，DMSO、PG、Sucro se和GSP組的NOS活性顯著地低于組內(nèi)其他濃度（P＜0.05）；10%的GSP冷凍睪丸組織后NOS活性為0.96 U／mgprot，顯著低于其他組（P＜0.05）；10%GSP組與10%PG 組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；7.5%GLY 冷凍睪丸組織后NOS活性為1.07U／mgprot，顯著低于組內(nèi)其他濃度（P＜0.05）。結果表明，10% GSP 能夠有效抑制睪丸組織中NOS活性。

表4 不同冷凍保護劑對睪丸組織中NOS的影響Table 4 Effects of different cryoprotectants on nitric oxide synthase of testicular tissue

3 討論

3.1 不同冷凍保護劑對犢牛睪丸組織冷凍保存的影響

本研究通過檢測犢牛睪丸組織冷凍保存后睪丸細胞活率、睪丸內(nèi)NO 水平和NOS活性，結果表明10% DMSO 作為冷凍保護劑冷凍保存犢牛睪丸組織，解凍后細胞活率達到77%，能較好抑制NO 水平和NOS活性；10% GSP在控制NO 水平和NOS活性方面效果比10%DMSO 好，但保護睪丸細胞活率方面能力較差。因此，10% DMSO 是冷凍犢牛睪丸組織最佳濃度的保護劑，此結果與Keros等［2］和Jahnukainen等［14］的研究結果一致。

對于不同冷凍保護劑對睪丸組織冷凍的效果，Jahnukainen等［14］研究認為，睪丸組織在超低溫冷凍過程的關鍵是冷凍保護劑的類型，不同的冷凍保護劑在冷凍效果上有很大差異，同時冷凍保護劑的濃度對冷凍效果也有很大影響。（10%蔗糖、5%和10%的DMSO 冷凍保存恒河猴睪丸組織，復蘇后將睪丸組織移植到裸鼠背部皮下，結果能夠啟動精子發(fā)生過程，然而經(jīng)過5% DMSO 冷凍睪丸后組織復蘇率差）。Keros等［2］比較了DMSO 和蔗糖對人睪丸組織的冷凍保存效果，表明10% DMSO 的保存效果最好，能有效保持睪丸組織形態(tài)結構尤其是精子發(fā)生，6%蔗糖的保護作用最差，蔗糖作為冷凍保護劑時，睪丸內(nèi)生精小管基底部、細胞間連接及睪丸基底嚴重損傷，證實DMSO 能很好的維持人睪丸組織的正常結構，適合于睪丸組織的冷凍保存。Frederickx等［15］報道，DMSO 對組織能提供較好的冷凍保護作用；Hovatta等［16］和Jezek 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，DMSO 冷凍保存細胞或組織時常用的濃度是10%～20%。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10% DMSO 冷凍－解凍后，犢牛睪丸細胞活率達到77%，NO 含量為0.52 μmol／mgprot，NOS活性為1.03U／mgprot，而5%DMSO 冷凍保存的犢牛睪丸組織解凍后，細胞復蘇率僅35%，NO 含量為1.20μmol／mgprot，NOS活性為1.54U／mgprot。本研究結果表明，DMSO 冷凍保存犢牛睪丸組織的最佳濃度是10%，此結果與Hovatta等［16］和Jezek 等［17］的報道一致。DMSO具有較好的滲透能力以及較低的分子量，能透過細胞膜將細胞質中的水分子置換出來，平衡細胞膜兩側溶液濃度，其自身獨特的化學結構不易在低溫環(huán)境下形成冰晶，因而保護了細胞結構的完整性。高濃度的DMSO 導致冷凍效果較差的主要原因是對細胞造成毒性損傷和滲透損傷等［18］。在超低溫冷凍保存過程中，高濃度冷凍保護劑對細胞及組織形成較大的毒性作用，在生殖細胞冷凍保存時導致染色體的異常變化，影響細胞存活和增殖。如果細胞在高溶質的溶液中時間過長，細胞膜上脂質分子會受到損傷，細胞發(fā)生滲漏，復溫時大量水分進入到細胞內(nèi)，造成細胞死亡。

本研究發(fā)現(xiàn)以GLY 作為冷凍保護劑的睪丸組織凍存效果不佳，7.5% GLY 冷凍后獲得最高細胞活率為41%，其原因可能是睪丸組織內(nèi)含有多種不同類型的細胞，每種細胞所適宜的保護劑不同，且GLY 滲透能力小，無法徹底滲透到睪丸組織深處，對深層細胞起不到保護作用［19］。唐立新等［19］研究發(fā)現(xiàn)，用PG 冷凍保存睪丸組織后，會嚴重損傷睪丸細胞的細胞核及染色體。本試驗經(jīng)10% PG 冷凍犢牛睪丸組織后，細胞活率達62%，NO 含量為0.51μmol／mgprot，NOS 活性為0.98 U／mgprot，對睪丸組織的保護能力不如DMSO 效果明顯。Tamura等［20］研究表明，原花青素具有抗氧化、抗基因突變、抑菌、清除自由基、抑制脂質過氧化等作用，原花青素還可以清除活性氧，減少甚至消除氧自由基對機體組織和器官的損害作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10% GSP冷凍犢牛睪丸組織后，NO 含量為0.49 μmol／mgprot，NOS活性為0.96U／mgprot，與其他冷凍保護劑相比能顯著降低NO 含量和NOS活性。脂質過氧化反應是不飽和脂肪酸氧化降解的鏈式反應過程，包括啟動、延伸、終止三個階段。延伸階段產(chǎn)生多種自由基，終止階段產(chǎn)生多種小分子物質，這些產(chǎn)物引起細胞功能損傷［21］。GSP 屬于黃酮類物質，可以通過酚羥基與自由基反應生成穩(wěn)定的半醌式自由基，終止自由基鏈式反應，達到減少和清除自由基的效果［22］。

3.2 梯度降溫法在犢牛睪丸組織冷凍保存中的應用

在細胞和組織的冷凍保存過程中，滲透性冷凍保護劑將細胞質中的水分子置換出來以避免在細胞質中形成冰晶而刺破細胞的膜結構［23］，非滲透性保護劑則在組織細胞膜外形成保護膜或利用糖類的羥基與細胞膜磷脂的磷酸根結合來置換細胞膜表明的水分子，從而防止冷凍時冰晶對細胞膜造成損傷［24］。因此，冷凍保護劑的主要成份實現(xiàn)以上物理或生化反應過程是發(fā)揮冷凍保護作用的前提條件，而這需要冷凍保護劑和睪丸組織有一個相互作用的過程。王麗［25］報道，由于精子中細胞質含量較少，精液直接投入液氮不會在精子細胞內(nèi)形成大的冰晶；而Jahnukainen等［14］研究表明，睪丸細胞具有完整的細胞結構和大量的細胞質，若直接投入液氮中，細胞質中和細胞膜表明的水分子立刻結成冰晶而無法被置換出來，且冰晶將直接損傷細胞，同時，由于冰晶的阻隔，非滲透性冷凍保護劑無法在細胞的膜結構周圍生成保護結構以發(fā)揮作用。本研究采用梯度降溫法冷凍睪丸組織，將渦旋震蕩混勻后的凍存管先在4 ℃冰箱中平衡3min，然后－20 ℃冰箱中平衡30min，再放入－80 ℃超低溫冰箱中12h，最后投入液氮罐中保存，這樣可保證冷凍保護劑有充足的時間和適宜的環(huán)境來置換細胞內(nèi)的水分并生成相關保護結構以發(fā)揮其最佳效果。

本研究表明，10% DMSO 適合用于冷凍犢牛睪丸組織，可以獲得較高的細胞活率，在睪丸組織冷凍時能較好保護組織降低低溫損傷。10% GSP 能顯著降低NO 含量和NOS活性，卻不能較好的保存犢牛睪丸組織細胞。因此，保護作用較好的滲透性和非滲透性冷凍保護劑之間的配伍效應以及配伍后對睪丸組織的冷凍保存效果有待深入研究。

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