韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘 成，章明海，牛應(yīng)澤,*

DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展

韋獻(xiàn)雅1，殷麗琴1，鐘 成2，章明海1，牛應(yīng)澤1,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究中心，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，四川 成都 611130）

植物化合物或植物提取物的抗氧化活性的體外評(píng)價(jià)是研究功能因子的一個(gè)重要方面。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法常用于評(píng)價(jià)化合物或植物提取物的抗氧化活性，但由于沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的方法，因而不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果難于相互比較。本文從DPPH法的原理、測(cè)定方法、檢測(cè)波長(zhǎng)、DPPH初濃度、反應(yīng)時(shí)間、清除率計(jì)算公式、結(jié)果表達(dá)、評(píng)價(jià)指標(biāo)等幾個(gè)方面對(duì)DPPH法做歸納總結(jié)，分析幾種外界因素對(duì)DPPH法的影響，有助于研究者提高認(rèn)識(shí)，從而準(zhǔn)確的開(kāi)展研究工作。

DPPH法；自由基；抗氧化劑；抗氧化活性

近年來(lái)自由基生物學(xué)快速發(fā)展，廣泛觸及生命科學(xué)領(lǐng)域，其主要探究自由基的組成、清除和自由基對(duì)生物學(xué)系統(tǒng)的損害。目前已明確一系列由自由基造成的疾病機(jī)理，如動(dòng)脈粥樣化、神經(jīng)變性、慢性抑郁癥、癌癥和生理學(xué)衰老[1]。抗氧化劑具有清除自由基的作用，對(duì)人體健康有益，已廣泛用于食品工業(yè)中。體外評(píng)價(jià)和篩選物質(zhì)抗氧化活性的方法有很多，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid） ammonium sal t，ABTS）法、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法、鐵離子還原法（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法[2]等。與其他相比，DPPH法有穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。DPPH法已在全世界范圍內(nèi)被廣泛用于自由基清除能力的定量分析[2]。

Blois[5]最先報(bào)道了DPPH法，發(fā)現(xiàn)DPPH自由基能被硫代半胱氨酸和其他活性物質(zhì)清除。此后，Brand-Williams 等[6]對(duì)DPPH法作了進(jìn)一步修訂，使之成為評(píng)價(jià)體外抗氧化活性的重要途徑。然而到目前為止DPPH法并沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)程序，尤其在反應(yīng)時(shí)間、體積比、DPPH自由基初濃度、結(jié)果表達(dá)等方面，使得很難比較不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作程序的結(jié)果[2,7-8]。本文主要從DPPH法的原理、 測(cè)定方法、檢 測(cè)波長(zhǎng)、DPPH自由基初濃度、反應(yīng)時(shí)間、清除率計(jì)算公式、結(jié)果表達(dá)、評(píng)價(jià)指標(biāo)等幾個(gè)方面做歸納總結(jié)，并介紹幾種外界因素對(duì)DPPH法的影響，以期為廣大研究者提供一定的參考。

1 DPPH法原理

DPPH自由基是一種人工合成的、穩(wěn)定的有機(jī)自由基，分子式為C12H12N6O6（Mr=394.32），其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有一個(gè)孤對(duì)電子（圖1）[9]。其甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，并在515～520 nm范圍有最大吸收峰[5-6]。當(dāng)向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對(duì)電子被配對(duì)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可以通過(guò)吸光度的變化進(jìn)行定量分析[10-11]。清除DPPH自由基是DPPH法的根據(jù)[12]。

圖1 DPPH自由基的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of DPPH free radical

根據(jù)反應(yīng)機(jī)制可將評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法基本分為兩種：基于H原子轉(zhuǎn)移（H-atom transfer， HAT）的反應(yīng)和基于電子轉(zhuǎn)移（electron transfer，ET）的反應(yīng)[13-14]。以酚類物質(zhì)（ArOH）為例，其清除DPPH自由基的反應(yīng)有兩種機(jī)制：直接提供酚的氫離子給DPPH自由基（HAT反應(yīng)），見(jiàn)式（1）；從酚（ArOH）或其酚陰離子（ArO·）轉(zhuǎn)移電子到DPPH自由基（ET反應(yīng)），見(jiàn)式（2）[15]。具體是哪一種途徑取決于溶劑的特性和/或待測(cè)物質(zhì)的氧化還原能力。一般在非極性溶液中HAT機(jī)制占優(yōu)越性，但在極性溶液中，如乙醇、甲醇，DPPH自由基能和酚（ArOH）形成較強(qiáng)的氫鍵，從而ET機(jī)制占主要[16]，二者也可同時(shí)發(fā)生[14]。

2 DPPH自由基清除率測(cè)定方法

測(cè)定DPPH自由基清除率的方法很多，使用最早、最頻繁的是分光光度計(jì)法[5-6]。另外，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒牧希藗兝酶咝б合嗌V技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）[17-20]、電子順磁共振技術(shù)（electron paramagnanetic resonance，EPR）[21-22]、薄層層析技術(shù)（thin layer chromatography，TLC）[23-24]等開(kāi)發(fā)了一些測(cè)定物質(zhì)清除DPPH自由基活性的新型方法。

2.1 分光光度計(jì)法

DPPH自由基在517 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收峰，當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后，517 nm波長(zhǎng)處的吸收值降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關(guān)系，反應(yīng)進(jìn)程很容易通過(guò)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)[5-6,25]。由于該方法簡(jiǎn)單、靈敏、快速，因此使用最廣泛。DPPH自由基清除計(jì)算公式一般為：

式中：A對(duì)照為未加樣品的DPPH自由基吸光度；A樣品為加入樣品反應(yīng)后的DPPH自由基吸光度。

2.2 HPLC

HPLC法是基于DPPH自由基吸收峰（PAs）的減少，來(lái)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的DPPH自由基清除活性。通過(guò)比較反應(yīng)前后DPPH自由基吸收峰（PAs）的變化，可靈敏地區(qū)分DPPH自由基吸收值的微小變化[17]。另外，通過(guò)HPLC法比較反應(yīng)前后待測(cè)物中各組分的吸收峰變化，可以判斷哪種組分的DPPH自由基清除活性高[20]。DPPH-HPLC法及DPPH-HPLC-MS法已成功用于篩選和鑒定復(fù)雜混合物質(zhì)中的抗氧化成分[20,26]。但是對(duì)于批量實(shí)驗(yàn)，該方法可能會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：PA空白為未加樣品的DPPH自由基吸收峰面積；PA樣品為加入樣品反應(yīng)后的DPPH自由基吸收峰面積。

2.3 EPR

運(yùn)用映照的修辭修辭格，將年幼時(shí)的“我們”與現(xiàn)在經(jīng)歷事件而走向不同的“我們”進(jìn)行對(duì)照，展現(xiàn)歲月終使“我們”走向分離的殘酷。

EPR是直接檢 測(cè)和研究含有未成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)的現(xiàn)代分析方法，具有簡(jiǎn)單、靈敏度高、樣品不受破壞和無(wú)干擾等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)自由基最直接、有效的方法之一[22]。由于DPPH自由基是穩(wěn)定的順磁化合物，適合EPR檢測(cè)。DPPH-EPR法直接測(cè)定自由基的濃度，顯著提高了分析的準(zhǔn)確性[21]。但由于成本較高，該方法使用并不常見(jiàn)。

3 DPPH法注意事項(xiàng)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

同一物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸收程度不一樣，檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇關(guān)系到吸光度的準(zhǔn)確性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液最大吸收波長(zhǎng)在500～520 nm。統(tǒng)計(jì)大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，使用頻率最高的是515 nm[16,27-29]和517 nm[8,10,18,30-31]，二者受青睞程度相當(dāng)。也有使用516 nm[32]和518 nm[23]的。若對(duì)波長(zhǎng)要求特別嚴(yán)格，可用掃描型分光光度計(jì)掃描DPPH自由基醇溶液的吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)。

3.2 DPPH自由基初濃度的選擇

關(guān)于DPPH自由基初濃度報(bào)道有很多（表1），沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定。有些研究者使用的DPPH自由基初濃度很高，導(dǎo)致反應(yīng)體系中DPPH自由基吸光度超出了分光光度法的準(zhǔn)確范圍[33-34]。根據(jù)比爾定律，分光光度計(jì)的靈敏度范圍在0.221～0.698，相當(dāng)于透光率在20%～60%[33]，對(duì)應(yīng)的適宜DPPH自由基濃度應(yīng)在25～70 μmol/L附近[8]。然而有很多人使用的DPPH自由基溶液濃度遠(yuǎn)超出了分光光度計(jì)的范圍，甚至達(dá)到了300 μmol/L[23]和500 μmol/L[35]。Scherer等[2]在實(shí)驗(yàn)中使用的DPPH溶液吸光度在2～3之間，超出了分光光度計(jì)的準(zhǔn)確范圍，因而其數(shù)據(jù)結(jié)果被人質(zhì)疑[36]。因此DPPH自由基初濃度不應(yīng)超出分光光度計(jì)的準(zhǔn)確范圍[36]。

表1 DPPH自由基溶液的初始濃度Table 1 Initial DPPH radical concentrations from literature

3.3 反應(yīng)時(shí)間

表2 DPPH法反應(yīng)時(shí)間Table 2 Reaction time for DPPH assay

不同文獻(xiàn)報(bào)道的DPPH法反應(yīng)時(shí)間不同（表2）。有調(diào)查表明，大部分的DPPH法研究都是基于20～30 min的固定反應(yīng)時(shí)間，而不是氧化還原反應(yīng)達(dá)到平衡的總時(shí)間[42]。DPPH法看似簡(jiǎn)單，許多抗氧化劑與DPPH自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)不同，或者甚至不反應(yīng)[29]，反應(yīng)達(dá)到平衡所需的時(shí)間也有所不同。如抗壞血酸與DPPH自由基的反應(yīng)迅速，幾乎在瞬間完成；而苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）與DPPH自由基反應(yīng)很緩慢，其吸光度在90 min的時(shí)間內(nèi)持續(xù)降低[8]，甚至需長(zhǎng)達(dá)6h達(dá)到反應(yīng)達(dá)平衡[29]。根據(jù)與DPPH自由基反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短，可將抗氧化物劃分為快速（＜30 min）、中速（0.5～1 h）和慢速（＞1 h）3類[29]。如抗壞血酸、β-胡蘿卜素、水溶性VE（Trolox）、沒(méi)食子酸丙酯[8,43]、芝麻酚、α-生育酚[29]與DPPH自由基反應(yīng)迅速，達(dá)平衡時(shí)間在30 min以內(nèi)；阿魏酸、沒(méi)食子酸、BHT[29]、(+)-兒茶素、(－)-表兒茶素[16]與DPPH反應(yīng)緩慢，平衡時(shí)間在0.5～3 h。另外，大部分的天然植物提取物成分復(fù)雜，與DPPH自由基反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，反應(yīng)緩 慢[16]。

然而很多研究者并沒(méi)有注意到反應(yīng)時(shí)間的重要性，使用較短的時(shí)間，往往不足以使反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[32]，使得許多抗氧化劑的活性被錯(cuò)誤估計(jì)。因此，在運(yùn)用DPPH法前，很有必要進(jìn)行混合體系的吸光度隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)，以準(zhǔn)確評(píng)估反應(yīng)時(shí)間[8,43]。Teow等[44]發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液的吸光度在3 h左右才達(dá)到平衡，故將反應(yīng)時(shí)間定為3 h。Azevedo等[38]每隔10 min測(cè)一次混合體系的吸光度，至30 min，從而確定反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間。

DPPH法自1958年被Blois[5]提出后，在Brand-Williams等[6]的不斷改進(jìn)下，確定DPPH自由基清除率計(jì)算見(jiàn)公式（5）。

式中：A對(duì)照為未加樣品的DPPH自由基吸光度，即DPPH自由基溶液＋溶劑；A樣品為加入樣品反應(yīng)平衡后的吸光度[5-6,20,29-30,36]，即DPPH自由基溶液+樣品溶液。

該計(jì)算公式適用于絕大多數(shù)情況，然而對(duì)于那些和DPPH在515 nm或517 nm處吸收光譜重疊的樣品來(lái)說(shuō)，樣品本身的吸收對(duì)結(jié)果有一定影響，應(yīng)該消除樣品的影響，于是將上面公式中的A樣品換成（A樣品－A空白），A空白為樣品的空白對(duì)照，即樣品本身的吸光度[23,28,43,48]，即樣品溶液＋溶劑。

因此，在使用DPPH法時(shí)應(yīng)根據(jù)樣品的吸收光譜，選擇對(duì)應(yīng)的清除率計(jì)算公式，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 DPPH自由基清除活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)

為了表示DPPH法的結(jié)果，并比較不同物質(zhì)的抗氧化活性，人們開(kāi)發(fā)了多種DPPH自由基清除活性指標(biāo)，如半數(shù)抑制濃度IC50、自由基清除能力AE、Trolox當(dāng)量等。常見(jiàn)指標(biāo)及其計(jì)算公式、優(yōu)缺點(diǎn)如下。

4.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率（I）[28,49]是評(píng)價(jià)物質(zhì)清除DPPH自由基活性的重要指標(biāo)之一，其計(jì)算見(jiàn)公式（7）。

式中：A對(duì)照為對(duì)照組吸光度；A樣品為樣品與DPPH自由基反應(yīng)平衡后的吸光度。自由基清除率越高，表明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)。該指標(biāo)簡(jiǎn)單、方便，使用頻率較高，但其易受樣品顏色和純度、DPPH自由基濃度、溶劑等因素影響；往往與半數(shù)效應(yīng)濃度EC50或半數(shù)抑制濃度IC50聯(lián)用。

4.2 DPPH自由基剩余率

DPPH自由基剩余率[32]表示反應(yīng)體系中某一時(shí)刻剩余的DPPH自由基濃度與初始DPPH自由基濃度之比，其計(jì)算見(jiàn)公式（8）。

式中：c（DPPH自由基）t=0和c（DPPH自由基）t分別為t=0和反應(yīng)過(guò)程中某一時(shí)刻t的DPPH自由基濃度。DPPH自由基剩余率越高，表明物質(zhì)清除的DPPH自由基越少，抗氧化活性越弱。該指標(biāo)要求準(zhǔn)確測(cè)量反應(yīng)時(shí)間和DPPH自由基濃度。

4.3 EC50或IC50

EC50為使DPPH自由基濃度降低50%的抗氧化劑濃度；IC50為DPPH濃度降到50%時(shí)的抗氧化劑濃度，二者的表達(dá)的意義相同。通過(guò)設(shè)置5～6個(gè)抗氧化劑濃度，制作濃度-清除率曲線，由于很多抗氧化劑濃度與DPPH自由基清除活性呈非線性關(guān)系，可通過(guò)GraphPad Prism?version 5.01、BleSq、OriginPro?8.5.1、SigmaPlot?12、BioDataFit?1.02和IBM SPSS Statistics?、Desktop 19.0等計(jì)算機(jī)程序中的回歸模型，計(jì)算得到EC50/IC50值。EC50/IC50值越大，抗氧化活性越小。EC50/IC50被使用頻率最高，但是其值隨著DPPH初濃度變化[30-31,50]。

4.4 自由基清除能力

自由基清除能力（ antiradical efficiency，AE）的計(jì)算見(jiàn)公式（9）。

式中：TEC50為抗氧化劑濃度在EC50時(shí)，反應(yīng)達(dá)平衡所需的時(shí)間。

AE值越大，自由基清除能力越強(qiáng)。AE同時(shí)考慮了EC50和反應(yīng)時(shí)間，被廣泛用于DPPH法結(jié)果的表達(dá)。AE同時(shí)考慮了EC50和反應(yīng)時(shí)間，被廣泛用于DPPH法結(jié)果的表達(dá)。但是測(cè)量TEC50耗費(fèi)時(shí)間，且反應(yīng)平衡是一個(gè)緩慢的動(dòng)態(tài)過(guò)程，判斷平衡時(shí)間存在困難[9,16,28,50]。

4.5 Trolox當(dāng)量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）

TEAC將給定物質(zhì)的抗氧化能力與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)Trolox比較。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制Trolox濃度與DPPH自由基清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線；再將待測(cè)物質(zhì)與DPPH反應(yīng)，得到清除率值，計(jì)算得到與該清除率相當(dāng)?shù)腡rolox濃度，進(jìn)而得到TEAC值，單位為μmol TE/g。

TEAC值越大，抗氧化能力越強(qiáng)。是DPPH法最常用的指標(biāo)之一[27,38]。

4.6 抗氧化劑活性指數(shù)（antioxidant activity index，AAI）AAI[2]的計(jì)算見(jiàn)公式（10）。

式中：IC50為半抑制濃度，結(jié)果不受DPPH濃度的影響，但是受抗氧化劑的濃度影響。使用較少。

4.7 抗氧化劑活性因子（antioxidant activity unit，AAU）

AAU[36]為完全清除1mol DPPH自由基所消耗的抗氧化劑摩爾數(shù)。計(jì)算見(jiàn)公式（11）。

式中：R為樣品溶液與DPPH溶液的體積比；B為擬合方程的斜率；c為DPPH自由基的初始濃度；Mr為樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

AAU值越小，抗氧化劑清除自由基能力越強(qiáng)。AAU值不受樣品和DPPH自由基濃度影響，但 是推到得到的公式中B為線性方程的斜率，公式本身有局限性；且還需知道樣品的相 對(duì)分子質(zhì)量，不適合測(cè)混合物和某些天然提取物的抗氧化活性。使用較少。

4.8 抗壞血酸當(dāng)量（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity，AEAC）

AEAC[30,51]表示100 g樣品的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg抗壞血酸的。計(jì)算見(jiàn)公式（12）。

式中：Ac為對(duì)照組吸光度；As為反應(yīng)液吸光度；AAA為抗壞血酸吸光度；ρAA為抗壞血酸（AA）質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V提取液為提取液體積/mL。AEAC的另一個(gè)計(jì)算見(jiàn)公式（13）。

5 影響DPPH法結(jié)果的外界因素

DPPH法除了受到反應(yīng)時(shí)間、DPPH初濃度、樣品性質(zhì)、計(jì)算公式、結(jié)果表達(dá)方式的影響[52]，還受到光照、氧氣、pH值、有機(jī)離子、無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響[4]。

5.1 無(wú)機(jī)離子

Blois[5]1958年曾報(bào)道無(wú)機(jī)離子影響了DPPH自由基清除活性的準(zhǔn)確測(cè)量。Al-Dabbas等[39]發(fā)現(xiàn)Na2S2O3和FeCl2能顯著降低DPPH自由基的顏色強(qiáng)度，即具有清除DPPH自由基的活性。MgCl2、CaCl2、K2SO3和K2SO4輕微增加了DPPH自由基的顏色強(qiáng)度。K2HPO4、KH2PO4、KCl、KF、KBr、KSCN、KNO3、CaCO3、K2CO3、K2CrO4、MnCl2和NaCl在質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)不影響DPPH自由基的顏色強(qiáng)度。另外，很多自由基清除劑如黃酮類物質(zhì)容易螯合鐵離子，以至不能準(zhǔn)確評(píng)估其DPPH自由基清除活性[39]。Dawid owicz等[39]發(fā)現(xiàn)溶解抗氧化劑的溶液中，金屬離子顯著影響著未反應(yīng)的DPPH自由基數(shù)量[32]。低價(jià)態(tài)的無(wú)機(jī)離子可能會(huì)干涉結(jié)果的準(zhǔn)確性，在測(cè)定時(shí)需剔除或分別測(cè)定。為了得到植物提取物的真實(shí)DPPH自由基清除活性，應(yīng)對(duì)其脫鹽化。

5.2 有機(jī)化合物

Roberto[53]發(fā)現(xiàn)，純的有機(jī)酸（乙酸、檸檬酸、蘋果酸）沒(méi)有DPPH自由基清除活性，但是當(dāng)VC混合后，能顯著增加VC的自由基清除效果，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。Dawidowicz等[32]發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中的乙酸乙酯、二惡烷降低了DPPH與BTH的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

5.3 緩沖溶液

Al-Dabbas等[39]發(fā)現(xiàn)醋酸緩沖液在0.01～0.2 mmol/L范圍內(nèi)沒(méi)有降低DPPH自由基的顏色，而磷酸緩沖液在超過(guò)0.05 mmol/L的濃度下，增強(qiáng)了DPPH自由基顏色。其認(rèn)為醋酸緩沖液可用于任何提取物，而磷酸緩沖液使用則有所限制。

5.4 光照、氧氣、pH值

Ozcelik等[4]發(fā)現(xiàn)，DPPH自由基甲醇溶液和DPPH自由基丙酮溶液在25℃的光照條件下放置120 min吸光度分別降低20%和35%，而在黑暗條件下放置150 min吸光度變化不明顯。分別在21%含氧量和1%含氧量的條件下放置90 min，前者的DPPH自由基降解程度顯著高于后者。在光下反應(yīng)120 min，pH 4的甲醇緩沖液中的DPPH自由基吸光度降低了55%，pH 10丙酮緩沖液中的DPPH自由基吸光度降低了80%。因此光照、氧氣、pH值會(huì)降低DPPH自由基的吸光度。

6 結(jié) 語(yǔ)

DPPH法是一種重要的檢測(cè)天然植物提取物或化合物抗氧化活性的方法，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，受到廣泛的歡迎。但是，DPPH法的結(jié)果容易受到多種因素的影響，為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)某物質(zhì)的清除DPPH自由基活性，應(yīng)選擇準(zhǔn)確的反應(yīng)時(shí)間、DPPH自由基初濃度、對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式和可靠的結(jié)果表達(dá)方式等。對(duì)于檢測(cè)植物提取物的抗氧化活性，為排除提取液中各種離子及化合物等其他成分的影響，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行脫鹽化處理或純化處理。DPPH法還受到溫度、光照、氧氣等自然因素影響，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要避光反應(yīng)，DPPH自由基溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。另外，反應(yīng)體系中的H2O、H+含量，DPPH自由基與抗氧化劑溶液的體積比等也會(huì)影響著DPPH法的結(jié)果，但是其機(jī)理和規(guī)律研究還不夠深入，值得進(jìn)一步探索。DPPH自由基與抗氧化劑的反應(yīng)過(guò)程和原理也值得進(jìn)一步探究。到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的DPPH法，使得不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果比較存在限制性。因此，DPPH法需要進(jìn)一步完善和標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)定的抗氧化活性指標(biāo)也需要統(tǒng)一。

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Advances in the DPPH Radical Scavenging Assay for Antioxidant Activity Evaluation

WEI Xian-ya1, YIN Li-qin1, ZHONG Cheng2, ZHANG Ming-hai1, NIU Ying-ze1,*
(1. Rapeseed Research Center, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

in vitro evaluation of the antioxidant activity of plant compounds or plant extracts is an important aspect of functional factor research. The DPPH (1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging assay is widely used for antioxidant activity evaluation of plant compounds and extracts. However, this method lacks a standardized program so that results from different experiments may be difficult to compare with each other. The present review presents a comprehensive overview of the principle, measurement procedure and wavelength, initial DPPH free radical concentration, reaction time, calculation of the scavenging rate, expression of results and evaluation indices. Several external factors influencing the DPPH assay are also discussed.

DPPH method; free radical; antioxidant; antioxidant activity

TS207.3

A

1002-6630（2014）09-0317-06

10.7506/spkx1002-6630-201409062

2013-06-25

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（12CGZHZX0712）；四川省教育廳重點(diǎn)科技項(xiàng)目（11LD018）

韋獻(xiàn)雅（1980—），女，博士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail：442891531@qq.com

*通信作者：牛應(yīng)澤（1955—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail：niuyz01@126.com