趙寧寧，何 慧，胡 琪，侯 燾，王 馳

脫鹽咸鴨蛋清促鈣吸收肽的制備及脫酰胺修飾

趙寧寧，何 慧*，胡 琪，侯 燾，王 馳

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

為使咸鴨蛋清得到高值化利用，本實(shí)驗(yàn)以電滲析脫鹽的咸鴨蛋清為原料，以可溶性鈣結(jié)合量、水解度為指標(biāo)，用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃 蛋白酶對(duì)脫鹽咸鴨蛋清進(jìn)行酶解，篩選出最佳實(shí)驗(yàn)用酶為Protamex復(fù)合蛋白酶；進(jìn)而對(duì)制備的蛋清肽進(jìn)行了脫酰胺處理，分析蛋清肽的氨基酸含量。結(jié)果表明：適合Protamex復(fù)合蛋白酶的酶解條件為加酶量2×104U/g、底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此條件下，水解度為21.97%，所得蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL。再經(jīng)脫酰胺修飾后，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加（P＜0.05）。氨基酸分析顯示蛋清肽中含有較多與鈣結(jié)合 相關(guān)的氨基酸。以脫鹽咸鴨蛋清為原料制備的肽具有較高的鈣結(jié)合活性，脫酰胺修飾可使其鈣結(jié)合能力顯著提升。

脫鹽咸鴨蛋清；酶解；肽；可溶性鈣結(jié)合量；脫酰胺

咸鴨蛋蛋清主要由水和蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)含量約為8.8%～12%，其氨基酸組成與人體需求的接近[1]，是一種全價(jià)蛋白；此外還含有10%左右的鹽。咸鴨蛋的消費(fèi)群主要在東南亞和中國(guó)[2]，尤其在中國(guó)，無(wú)論是總量還是人均消費(fèi)水平均為世界第一。據(jù)初步估算，每年我國(guó)有上百億枚咸鴨蛋黃被用于制作粽子、月餅等食品， 遺留下數(shù)以萬(wàn)噸計(jì)的咸鴨蛋蛋清因含鹽量高達(dá)7%～12%，被極大地限制了應(yīng)用范圍[3]。

一直以來(lái)，咸鴨蛋 蛋清僅有極少被用于餅干、飼料及面條等的加工制作，近年來(lái)也有人用咸蛋清生產(chǎn)咸蛋清粉和一些類(lèi)似腐乳的產(chǎn)品[4]，或者將咸蛋清直接與魚(yú)糜混合以增加魚(yú)糜的凝 膠性能[5]，但絕大部分咸蛋清還是遭到丟棄，造成了極大優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。因此，對(duì)咸鴨蛋清進(jìn)行有效脫鹽，并 使其增值具有良好的應(yīng)用前景。

鈣營(yíng)養(yǎng)不足是當(dāng)今全球性的健康問(wèn)題，由于中國(guó)人的膳食大量攝入植物性食物，其中的草酸、磷酸和植酸等在腸道中易與攝入的鈣形成不溶性鹽，從而導(dǎo)致鈣的生物利用率降低。研究表明，氨基酸、肽等能和鈣形成可溶性配合物，從而阻止小腸內(nèi)鈣沉淀，更好地促進(jìn)鈣的吸收。乳制品是值得信賴(lài)的、高效的補(bǔ)鈣食品，因?yàn)槔业鞍自谙^(guò)程中形成的酪蛋白磷酸肽[6]能與鈣形成可溶性的螯合物，有利于鈣的吸收。此后陸續(xù)有卵黃高磷蛋白磷酸肽[7]、大豆肽[8]、魚(yú)骨肽[9]、蝦殼肽[10]、乳清蛋白肽[11]等促鈣吸收肽的研究見(jiàn)諸報(bào)道。以食品工業(yè)副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)促鈣吸收肽，已成為了一種趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室也曾報(bào)道了雞蛋蛋清肽[12]具有促鈣吸收作用。然而，目前人們對(duì)咸鴨蛋蛋清酶解的研究，多數(shù)以獲取較高水解度的肽為目的來(lái)制取抗氧化肽[2,13-15]。本實(shí)驗(yàn)以電滲析脫鹽的咸鴨蛋蛋清為原料，以可溶性鈣結(jié)合量為主要指標(biāo)，結(jié)合水解度，篩選出較佳用酶，制備高活性促鈣吸收鴨蛋清肽，并對(duì)其進(jìn)行脫酰胺修飾以提升其鈣結(jié)合能力，為充分利用咸鴨蛋蛋清資源，提高其附加值，開(kāi)發(fā)出新的生物利用率高的補(bǔ)鈣產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋蛋清（鹽含量約為70 g/L，蛋白質(zhì)含量約為105 g/L） 湖北神丹健康食品有限公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶 丹麥Novozymes公司；Trypsin胰蛋白酶、Pepsin胃蛋白酶 美國(guó)Amresco公司；谷氨酰胺酶 日本天野酶制劑；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

小型實(shí)驗(yàn)用特種電驅(qū)動(dòng)膜分離器 浙江千秋環(huán)保水處理有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10 Sartorius標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；TDL-5A臺(tái)式低速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV-102-02WF紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；Laborota4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國(guó)Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 脫鹽咸鴨蛋蛋清的制備

參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究[16]對(duì)咸鴨蛋蛋清進(jìn)行脫鹽處理：咸鴨蛋蛋清→前處理除雜→稀釋10 倍電滲析脫鹽→超濾濃縮5 倍→冷凍干燥→鴨蛋蛋清粉。

1.3.2 促鈣吸收鴨蛋蛋清肽的制備

1.3.2.1 酶解工藝

鴨蛋蛋清（為脫鹽咸鴨蛋蛋清，下同）→按一定濃度加入蒸餾水→攪拌均勻，沸水浴預(yù)處理40 min→冷卻至所用酶的最適溫度，調(diào)至該酶的最適pH值→加酶→用0.1 mol/L NaOH維持pH值在最適條件，酶解一段時(shí)間并記錄NaOH用量→沸水浴滅酶10 min→冷卻，4 000 r/min離心10 min→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→測(cè)定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.2.2 蛋白酶的篩選

在Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin、Pepsin各種蛋白酶廠家推薦的最適反應(yīng)條件（表1）下，按底物質(zhì)量濃度40 g/L、酶解時(shí)間4 h、加酶量 20 000 U/g進(jìn)行酶解，以可溶性鈣結(jié)合量和水解度為指標(biāo)，篩選最佳蛋白酶。

表1 各種蛋白酶最適反應(yīng)條件Table 1 The optimal reaction conditions for the selected proteases

1.3.2.3 復(fù)合蛋白酶酶解鴨蛋蛋清的單因素試驗(yàn)

以pH值、溫度、加酶量、底物質(zhì)量濃度、 酶解時(shí)間為單因素變量，以可溶性鈣結(jié)合量為主要活性指標(biāo)，水解度為輔助指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，各單因素變量水平如下：50 ℃、底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量2×104U/g、酶解3 h，考察pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的影響；在底物質(zhì)量濃度40 g/L、加酶量2×104U/g、酶解3 h、pH 6.5條件下，考察溫度45、50、55、60 ℃影響；在底物質(zhì)量濃度 40 g/L、反應(yīng)3 h、pH 6.5、50 ℃條件下，考察加酶量 5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 U/g的影響；在50 ℃、pH 6.5，加酶量2×104U/g，酶解反應(yīng)3 h的條件下，考察底物質(zhì)量濃度20、30、40、50、60 g/L的影響；在底物質(zhì)量濃度40 g/L、pH 6.5、50 ℃、加酶量2×104U/g條件下，考察酶解時(shí)間2、3、4、5、6 h的影響。

1.3.2.4 復(fù)合蛋白酶酶解鴨蛋蛋清的正交試驗(yàn)

進(jìn)一步對(duì)復(fù)合蛋白酶酶解工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō)，最適pH值和溫度基本不變，固定pH值和溫度，選擇加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間三因素為變量，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.3 鴨蛋蛋清肽的脫酰胺化

將上述鴨蛋蛋清肽配成20 g/L的溶液，于50 ℃、pH 7.0條件下添加 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%谷氨酰胺酶，分別在反應(yīng)時(shí)間0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時(shí)取樣，凍干后測(cè)定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.4 鴨蛋蛋清肽氨基酸分析

參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成。

1.3.5 可溶性鈣結(jié)合量的測(cè)定

測(cè)定方法參照Sato等[17]的方法，略做改進(jìn)：將5 mmol/L CaCl2和20 mmol/L pH 7. 8的磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣沉淀，加入一定量的鴨蛋蛋清肽，37 ℃保溫2 h，10 000 r/min離心15 min，取適量上清液采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法[18]測(cè)定可溶性鈣結(jié)合量。

1.3.6 水解度的測(cè)定

Alcalase 2.4 L、Neutrase 0.8 L、Protamex、Trypsin酶解水解度（degree of hydrolysis，DH）的測(cè)定采用pH-stat法[12]，Pepsin酶解水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[19]。

采用pH-stat法時(shí)，式中：α為α-氨基解離度，α = [10（pH－pK）]/[1＋10（pH－pK）]，其中pK＝7.0，pH為酶解pH值；V為消耗NaOH的體積/mL；c為NaOH的濃度/（mol/L）；mp為底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；htot為每克原料蛋白中肽鍵數(shù)/（mmol/g），對(duì)鴨蛋清蛋白而言取11.1 mmol/g。

采用甲醛滴定法時(shí)，式中：h為酶解液中－NH2或－COOH的含量/（mmol/g）；h0為原料蛋白中－NH2或－COOH的含量/（mmol/g）。

1.3.7 蛋白酶活力的測(cè)定

參 照國(guó)標(biāo)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》。酶活力的定義為：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1 個(gè)酶活力單位，以1 U/g（U/mL）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種蛋白酶酶解效果比較

表2 5 種蛋白酶酶解效果比較Table 2 Comparative hydrolysis of duck egg white by diffident proteases

在各種蛋白酶的最適溫度和最適p H值條件下酶解鴨蛋蛋清后，所得酶解液的可溶性鈣結(jié)合量和水解度結(jié)果如表2所示。就酶解液的可溶性鈣結(jié)合量指標(biāo)而言，以P r o t a m e x酶解液最高，達(dá)到15.79 μg/mL，極顯著高于其余4 種酶（P＜0.01）；其次為Pepsin和Trypsin，在3～4 μg/mL之間；最低的為Alcalase 2.4 L， 僅有1.56 μg/mL。就水解度指標(biāo)而言，Protamex為19.36%，低于Alcalase 2.4 L的20.96% （P＜0.05），但極顯著高于其余3種酶（P＜0.01）。Neutrase 0.8 L酶解物的水解度達(dá)到14.24%，其余2 種酶均低于5%。作為促鈣吸收肽，可溶性鈣結(jié)合量是主要指標(biāo)，綜合考慮Protamex在可溶性鈣結(jié)合量和水解度方面比其余4 種酶存在一定優(yōu)勢(shì)，可能是因?yàn)槠溆?種酶屬于內(nèi)切酶，而Protamex是復(fù)合酶，相比而言酶切位點(diǎn)更寬，釋放出的鈣結(jié)合位點(diǎn)更多。因而后續(xù)僅對(duì)Protamex酶解條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 Protamex酶解鴨蛋蛋清單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖1 pH值對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.1 Effect of pH on the enzymolysis of duck egg white

反應(yīng)pH值對(duì)鴨蛋蛋清酶解效果的影響如圖1所示。pH值在6.0～7.5時(shí)，對(duì)可溶性鈣結(jié)合量無(wú)顯著性影響（P＞0.05），在pH 6.5時(shí)其可溶性鈣結(jié)合量稍高，達(dá)到26.89 μg/mL；繼續(xù)增大pH值至8.0時(shí)，可溶性鈣結(jié)合量顯著降低（P＜0.05），僅為3.5 μg/mL。水解度則隨著pH值的增加先增大后減小，在pH 6.5時(shí)達(dá)到最大為21.20%，顯著高于其余4 個(gè)值（P＜0.05）。這是因?yàn)槊阜肿咏Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受到pH值的影響，過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)加劇酶蛋白的失活，Protamex為中性酶，在中性條件下酶活力較高。Protamex在pH 6.5時(shí)可溶性鈣結(jié)合量和水解度均較高，故選取最佳pH值為6.5，這與廠家推薦的最優(yōu)pH值相一致。

2.2.2 溫度對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

反應(yīng)溫度對(duì)酶解效果的影響如圖2所示。由于Protamex最適溫度范圍為50～60 ℃，故選取單因素溫度范圍為45～60 ℃。隨著溫度逐漸升高，可溶性鈣結(jié)合量和水解度也逐漸增強(qiáng)，50～55 ℃達(dá)到最大，均顯著高于45 ℃和60 ℃（P＜0.05），之后開(kāi)始逐漸下降，這是因?yàn)槊傅幕钚噪S著溫度升高不斷受到抑制。由于50 ℃和55 ℃對(duì)兩種指標(biāo)的影響均不顯著（P＞0.05），考慮到節(jié)能，故選定最佳酶解溫度為50 ℃。

圖2 溫度對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.2 Effect of temperature on the enzymolysis of duck egg white

2.2.3 加酶量對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖3 加酶量對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the enzymolysis of duck egg white

加酶量對(duì)酶解效果的影響如圖3所示。隨著酶量的增加，酶解程度不斷增加，當(dāng)加酶量達(dá)到2×104U/g后，水解度仍有增加，但整體趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明反應(yīng)所需的酶量接近飽和。然而，酶量的繼續(xù)增加會(huì)使可溶性鈣結(jié)合量顯著減?。≒＜0.05），說(shuō)明肽鏈并非越短越好，過(guò)度水解會(huì)使合適的肽段降解，故宜將加酶量控制在2×104U/g為好。

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the enzymolysis of duck egg white

底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響如圖4所示。隨著底物質(zhì)量濃度增大，水解度先是緩慢減小，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L后，減小幅度顯著增加（P＜0.05）；可溶性鈣結(jié)合量則是先不斷增大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，達(dá)到最大，之后隨著底物質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，可溶性鈣結(jié)合量顯著減?。≒＜0.05）。這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度較低時(shí)，酶可與底物充分接觸，因而水解度較高，如前分析過(guò)高的水解度并非對(duì)提升鈣結(jié)合量有利；實(shí)驗(yàn)顯示隨著底物質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，鴨蛋清的溶解會(huì)受到一定影響，酶解過(guò)程中很容易形成凝膠狀態(tài)，從而影響酶與底物的充分接觸，同時(shí)蛋清蛋白過(guò)量也造成了資源浪費(fèi)，故水解度和可溶性鈣結(jié)合量降低。由此可知，宜將底物質(zhì)量濃度控制在40 g/L時(shí)為宜。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解鴨蛋蛋清蛋白的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解鴨蛋清蛋白的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the enzymolysis of duck egg white

酶解時(shí)間對(duì)可溶性鈣結(jié)合量和水解度的影響如圖5所示。在3 h之前，可溶性鈣結(jié)合量顯著升高（P＜0.05），之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性鈣結(jié)合量顯著減?。≒＜0.05）后趨于不變；水解度也隨時(shí)間的增加迅速升高，反應(yīng)4 h后水解度基本平穩(wěn)（P＞0.05）。其原因可能是隨著酶解的進(jìn)行，底物蛋白被不斷酶切，許多鈣結(jié)合點(diǎn)位被不斷釋出，故可溶性鈣結(jié)合量增加，之后繼續(xù)酶切會(huì)使合適的肽段降解，可溶性鈣結(jié)合量反而降低；由于底物質(zhì)量濃度是一定的，隨著時(shí)間延長(zhǎng)酶解達(dá)到飽和，水解度增大到一定程度后也趨于平緩。因此選擇酶解時(shí)間3 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Protamex酶解鴨蛋蛋清蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析如表3、4所示。就可溶性鈣結(jié)合量而言，影響其大小的因素順序依次為：B＞A＞C，其最佳酶解工藝條件為A3B1C3；影響水解度大小的順序?yàn)椋篈＞B＞C，其最佳酶解工藝條件與以可溶性鈣結(jié)合量為指標(biāo)的條件相吻合，亦為A3B1C3。加酶量和底物質(zhì)量濃度對(duì)兩指標(biāo)的影響達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），酶解時(shí)間的影響相對(duì)較小。綜上所知，最佳酶解條件為：復(fù)合蛋白酶加酶量2×104U/g、蛋清底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50 ℃、pH 6.5，酶解3.5 h。在此條件下，酶解水解度為21.97 %，所得鴨蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL（5.84 mg Ca/g肽）。

表3 Protamex酶解鴨蛋蛋清蛋白正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design scheme with experimental results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 鴨蛋蛋清肽的脫酰胺化

圖6 脫酰胺化對(duì)鴨蛋蛋清肽可溶性鈣結(jié)合量的影響Fig.6 Effects of deamination of duck egg white peptides on the amount of soluble calcium-binding peptides

用谷氨酰胺酶對(duì)肽段進(jìn)行脫酰胺處理后，可以使肽段中酰胺類(lèi)氨基酸（例如谷氨酰胺和天冬酰胺）側(cè)鏈上的酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸然欣谂c鈣離子配位，即羧基增多，配位點(diǎn)位增多，故鈣結(jié)合能力增強(qiáng)。樣品的可溶性鈣結(jié)合量隨著谷氨酰胺酶處理時(shí)間的變化曲線如圖6所示，鴨蛋蛋清肽經(jīng)過(guò)脫酰胺處理后，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加（P＜0.05），并且隨著谷氨酰胺酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，在1.5～3.0 h變化不顯著，繼續(xù)延長(zhǎng)脫酰胺時(shí)間至4 h時(shí)，其結(jié)合鈣能力反而有所下降，但此時(shí)仍顯著高于未脫酰胺的鴨蛋清肽（P＜0.05）。Jin Donghao等[20]研究發(fā)現(xiàn)脫酰胺后的大豆蛋白酶解物阻止碳酸鈣結(jié)晶形成的能力增強(qiáng)；包小蘭[8]曾報(bào)道了脫酰胺后的大豆肽其鈣結(jié)合能力提升；此外，對(duì)酪蛋白進(jìn)行谷氨酰胺酶脫酰胺處理后，也發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物結(jié)合Ca2+、Fe3+的能力增強(qiáng)[21]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鴨蛋蛋清肽脫酰胺處理后，旨在進(jìn)一步提高其鈣結(jié)合能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明鴨蛋蛋清肽中的羧基尤其是谷氨酸和天冬氨酸殘基側(cè)鏈上的羧基對(duì)提高鈣結(jié)合能力有著重要貢獻(xiàn)。

2.5 鴨蛋蛋清肽氨基酸分析結(jié)果

表5 脫鹽咸鴨蛋蛋清蛋白、鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid duck egg white and duck egg white peptides g/100 g

由表5可知，脫鹽咸鴨蛋蛋清蛋白和鴨蛋蛋清肽的氨基酸組成相差不大，氨基酸總量均在85%左右，酸性氨基酸與堿性氨基酸的含量也基本相似。兩者相比，前者的Cys、Pro、Arg高于后者，后者的Phe、Tyr、Leu和His高于前者。有研究報(bào)道[8,10,22-23]，除了磷酸化肽能與鈣有效結(jié)合外，一些非磷酸化肽的酸性氨基酸羧基、堿性氨基酸側(cè)鏈上的氨基氮以及His的咪唑基均是鈣的結(jié)合位點(diǎn)，鴨蛋蛋清肽中這3 類(lèi)氨基酸總量為38.59%，和大豆肽相似（37.64%[8]）。此外，Ser、Thr、Tyr、Met是目前認(rèn)為主要能夠被磷酸化的氨基酸[18]，其中Ser、Thr能被磷酸化的概率又高于其余兩種氨基酸。鴨蛋蛋清肽中此類(lèi)氨基酸總量為24.59%，顯著高于大豆肽（7.75%[8]）。Lee等[24]進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化后的大豆肽其鈣結(jié)合能力顯著增加，若對(duì)鴨蛋蛋清肽進(jìn)行磷酸化修飾，其鈣結(jié)合量能力有望進(jìn)一步提升。

3 討論與結(jié)論

目前對(duì)于雞蛋蛋清酶解制肽的研究較多，而對(duì)鴨蛋蛋清酶解制肽的研究相對(duì)較少，且這些研究多以追求較高水解度為目的，因?yàn)樗舛仍礁撸玫降男‰妮^易吸收。例如吳暉等[19]以鮮鴨蛋清為原料制備了高水解度的鴨蛋清肽，確定了以堿性蛋白酶-胰蛋白酶組成的雙酶分步水解工藝效果最佳，水解度可達(dá)26.6%；王曉玲等[1]直接以咸鴨蛋清為原料，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶質(zhì)量比為4∶6（加酶總量為4 500 U/g pro）時(shí)酶解液水解度達(dá)到了23.10%；以脫鹽蛋清為底物，采用木瓜蛋白酶酶解獲取的蛋清肽水解度也達(dá)到了23.2%[15]。本實(shí)驗(yàn)旨在追求較高的可溶性鈣結(jié)合量，在此前提下，得出以復(fù)合蛋白酶酶解脫鹽咸蛋清最佳，其水解度也達(dá)到了21.97%，提示可能促鈣吸收蛋清肽的分子質(zhì)量較小，這也是有利于吸收的。

由蛋清酶解制備的肽，其活性主要涉及抗氧化、降血壓、抗疲勞等。對(duì)于促鈣吸收肽而言，高鈣結(jié)合量是其重要指標(biāo)，而適當(dāng)?shù)乃舛炔拍鼙ＷC較高的鈣結(jié)合率。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)雞蛋蛋清肽的制備研究發(fā)現(xiàn)[12]，單酶酶解雞蛋蛋清時(shí)，沒(méi)有一種酶能使酶解液中可溶性鈣結(jié)合量和水解度兩項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)較高，用Neutrase 0.8 L和Alcalase 2.4 L雙酶復(fù)合酶解雞蛋蛋清后，所得雞蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為21.15 μg/mL，水解度為8.66%；而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Protamex復(fù)合蛋白酶酶解后，酶解液能兼具較高可溶性鈣結(jié)合量和水解度?？赡苁且?yàn)閷?duì)雞蛋蛋清酶解研究時(shí)，采用的5 種酶均為內(nèi)切酶，而Protamex復(fù)合蛋白酶兼具內(nèi)切與外切的功能，酶切位點(diǎn)更寬；鴨蛋蛋清與雞蛋蛋清雖然蛋清蛋白組成有相似性，但畢竟氨基酸組成不同。本實(shí)驗(yàn)采用的是脫鹽咸鴨蛋蛋清，高鹽含量對(duì)蛋白的組成稍有影響。此外，有報(bào)道[8]采用蛋白酶M酶解大豆蛋白，獲取的大豆肽可溶性鈣結(jié)合量為2.7 mg Ca/g肽，本實(shí)驗(yàn)獲得的鴨蛋蛋清肽，其鈣結(jié)合能力（5.84 mg Ca/g肽）遠(yuǎn)高于此大豆肽。

本實(shí)驗(yàn)以脫鹽咸鴨蛋清為原料，確定了Protamex復(fù)合蛋白酶對(duì)蛋清蛋白的酶解工藝，獲取了有較高鈣結(jié)合能力的鴨蛋蛋清肽，可以與鈣生成可溶物。最佳酶解工藝為：Protamex復(fù)合蛋白酶加酶量2×104U/g、蛋清底物質(zhì)量濃度30 g/L、溫度50℃、pH 6.5、酶解3.5 h。在此條件下，酶解水解度為21.97%，所得鴨蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量為29.22 μg/mL（5.84 mg Ca /g肽）。脫酰胺化后的蛋清肽，其可溶性鈣結(jié)合量顯著增加，氨基酸分析結(jié)果也顯示蛋清肽中有較多與鈣結(jié)合相關(guān)的氨基酸。以脫鹽咸鴨蛋清為原料制備的鴨蛋蛋清肽具有較高的鈣結(jié)合活性。

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Preparation and Deamination of Calcium Absorption-Promoting Peptides from Desalted Duck Egg White

ZHAO Ning-ning, HE Hui*, HU Qi, HOU Tao, WANG Chi
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

To prepare high-activity peptides with calcium absorption-promoting function, desalted duck egg white after electro-dialysis was hydrolyzed by one of fi ve enzymes (alcalase 2.4 L, neutrase 0.8 L, protamex, trypsin, and pepsin), and then deamidation and amino acid composition analysis of the peptides were conducted. The results showed that protamex was selected as the optimal enzyme wh en the amou nt of soluble calcium-binding peptide and the degree of hydrolysis (DH) were measured. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows: Protamexdosage 20 000 U/g, substrate concentration 30 g/L, temperat ure 50 ℃, pH 6.5, and hydrolysis time 3.5 h. Under these conditions, the DH reached 21.97% and the amount of soluble calcium-binding peptide was 29.22 μg/mL. After deam idation, the amoun t of soluble calciumbinding peptides was increased significant ly (P ＜ 0.05). Amino a cid analysis revealed that a lot of amino acids in the peptides contributed to the calcium-binding capacity. Conclusion: Desalted duck egg white can be used to pro duce highactivity peptides with calcium absorption-promoting functions and deamidation of duck egg white peptides can increase the amount of soluble calcium-binding peptides signifi cantly.

desalted duck egg white; enzymatic hydrolysis; peptides; amount of soluble calcium-binding peptide; deamidation

TS253.9

A

1002-6630（2014）09-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201409036

2013-07-01

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（52902-0900205118）

趙寧寧（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：zhao90nn@163.com

*通信作者：何慧（1960—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn