張榮躍，黃應(yīng)昆，李文鳳，羅志明，申 科，王曉燕，尹 炯，單紅麗

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn)661699）

甘蔗主栽品種宿根矮化病調(diào)查及病原檢測

張榮躍，黃應(yīng)昆，李文鳳，羅志明，申 科，王曉燕，尹 炯，單紅麗

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn)661699）

對中國云南和廣西甘蔗主產(chǎn)區(qū)幾個(gè)主栽甘蔗品種的宿根矮化病進(jìn)行了調(diào)查和田間采樣，采用PCR檢測法，對田間采集的20個(gè)主栽品種的393個(gè)樣本進(jìn)行RSD檢測。結(jié)果表明，20個(gè)主栽品種中有19個(gè)品種檢測出RSD，陽性檢出率9.23%～100%，393個(gè)樣本中有234個(gè)樣本為陽性，陽性檢出率59.54%。本研究表明，云南和廣西幾個(gè)主產(chǎn)蔗區(qū)的主栽品種RSD感病嚴(yán)重。

甘蔗；宿根矮化病；主栽品種；病原檢測

甘蔗宿根矮化?。≧atoon Stunting Disease，RSD）是一種世界性的重要甘蔗病害，由一種寄居木質(zhì)部的細(xì)菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）引起[1]。該病于1944年首先在澳大利亞昆士蘭州甘蔗品種Q28上發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)已遍布世界各蔗區(qū)。中國大陸于1986年首次確診存在RSD[3]。蔗株染病后矮化，分蘗減少，蔗莖變細(xì)，節(jié)間縮短，一般減產(chǎn)12%～37%，蔗糖分降低0.5個(gè)百分點(diǎn)[4]。RSD沒有明顯的外部和內(nèi)部癥狀，從外觀難以鑒定，從而導(dǎo)致病害經(jīng)種莖和刀具等傳播蔓延，危害極大[5]。

目前對RSD有效的防治方法是生產(chǎn)、繁殖和推廣脫毒健康種苗，而摸清蔗區(qū)RSD發(fā)生危害情況，是科學(xué)防控RSD的關(guān)鍵。為此，我們于2012年對云南鳳慶、勐海、施甸、昌寧、盈江和廣西宜州、武宣、象州等中國甘蔗主產(chǎn)區(qū)主栽品種的宿根矮化病進(jìn)行了調(diào)查和田間采樣，采用PCR檢測技術(shù)進(jìn)行RSD檢測，分析明確這幾個(gè)甘蔗主產(chǎn)區(qū)主栽品種的RSD發(fā)生危害情況，為推廣應(yīng)用脫毒健康種苗，有效防控RSD提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與樣品采集

于2012年甘蔗成熟期，對云南鳳慶、勐海、施甸、昌寧、盈江和廣西宜州、武宣、象州等甘蔗主產(chǎn)區(qū)的宿根矮化病進(jìn)行了調(diào)查取樣。采樣選擇具有代表性的主栽品種，共采集了393個(gè)樣本。取樣和榨汁方法參照李文鳳等人的方法[6]。

1.2 PCR檢測

1.2.1 蔗汁DNA的提取取4mL蔗汁，12000r/min 4℃離心15min，棄上清，沉淀加300μL滅菌雙蒸水混勻；加入600μL經(jīng)65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，65℃水浴1h，期間顛倒離心管數(shù)次；加入600μL氯仿/異戊醇（24∶1）充分混勻，12000r/min離心10min；取上清，加入2/3體積的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱中沉淀2h；12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干后，溶于30μL ddH2O中，-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增引物序列采用文獻(xiàn)[7]報(bào)道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S～23SrDNA基因間隔區(qū)特異引物，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為438bp。其序列為：

上游引物L(fēng)xx1：5＇-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3＇

下游引物L(fēng)xx2：5＇-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3＇

PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括2×PCR Taq Master 8μL，Lxx1和Lxx2各0.2 μL，ddH2O 8.6μL，DNA 3μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃5min。

2 結(jié)果與分析

采用PCR檢測法對采集的20個(gè)品種393個(gè)樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果（表1）表明，20個(gè)主栽品種中除柳城03-1137檢測為陰性外，其余品種ROC16、ROC20、ROC22、ROC25、粵糖00-236、粵糖79-177、粵糖86-368、粵糖93-159、桂糖02-208、桂糖02-761、桂糖11、桂糖94-119、閩糖69-421、云引3、云引58、盈育91-59、臺糖95-8899、園林1、贛蔗18均檢測出陽性，陽性檢出率9.23%～100%；393個(gè)樣本中有234個(gè)樣本檢測為陽性，陽性檢出率59.54%；主栽品種ROC16、粵糖00-236、粵糖93-159、桂糖11、桂糖94-119等8個(gè)品種感病嚴(yán)重，陽性檢出率高達(dá)80%以上；而ROC22、粵糖86-368和云引3號這3個(gè)品種發(fā)病較輕，陽性檢出率低于20%。

3 結(jié)論與討論

RSD是一種造成甘蔗減產(chǎn)、品質(zhì)下降和宿根年限縮短，嚴(yán)重危害甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的病害，在各蔗區(qū)都發(fā)生嚴(yán)重。沈萬寬等對湛江農(nóng)墾蔗區(qū)甘蔗RSD的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，RSD檢出率為62.84%[8]。黃應(yīng)昆等采用電鏡負(fù)染法和I-ELISA對中國云南部分蔗區(qū)進(jìn)行抽查，RSD檢出率達(dá)69.05%[9]。鄧展云等采用PCR檢測法對廣西部分蔗區(qū)進(jìn)行抽查，其中桂糖11號RSD檢出率達(dá)86%[10]。本研究明確了云南和廣西幾個(gè)甘蔗主產(chǎn)區(qū)主栽品種RSD發(fā)生危害情況，檢測的20個(gè)主栽品種中有19個(gè)品種感染RSD，陽性檢出率達(dá)到59.54%，由此可見，云南和廣西這幾個(gè)蔗區(qū)的主栽品種中RSD發(fā)生率普遍較高，已達(dá)到了相當(dāng)嚴(yán)重的程度。

種植健康種苗是防治甘蔗RSD的主要措施，已在巴西、古巴、澳大利亞等國應(yīng)用多年，甘蔗健康種苗生產(chǎn)方法主要有兩種途徑，即溫水脫毒和組培脫毒。盧文潔等研究表明溫水脫毒對甘蔗有明顯的增產(chǎn)增糖效果，新植公頃增產(chǎn)最高49830kg，1年宿根公頃增產(chǎn)最高達(dá)29895kg，2年宿根公頃增產(chǎn)最高達(dá)23656kg，蔗糖分提高0.35%～0.86%，宿根年限延長2～3年[11]，而應(yīng)用甘蔗組織培養(yǎng)既可去除甘蔗RSD病菌又可以脫去甘蔗病毒獲得健康種苗。本研究表明，大面積主栽品種ROC16、桂糖94-119、粵糖93-159、粵糖00-236、桂糖11等品種感病嚴(yán)重，應(yīng)重點(diǎn)對這幾個(gè)品種進(jìn)行脫毒健康種苗生產(chǎn)繁殖和推廣應(yīng)用?，F(xiàn)有主栽品種大部分對RSD缺乏抗性或抗性不強(qiáng)，而本研究表明柳城03-1137、云引3號、ROC22等發(fā)病率較低，抗病性較強(qiáng)，是選育抗宿根矮化病甘蔗品種很有利用潛力的抗源種質(zhì)，在大力推廣應(yīng)用的同時(shí)，可作為抗病親本利用，選育抗宿根矮化病甘蔗新品種，供生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示了不同品種RSD感染狀況，為生產(chǎn)繁殖推廣應(yīng)用脫毒健康種苗和RSD抗病資源篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

表1 甘蔗宿根矮化病發(fā)生情況

[1]Davis MJ,Gillaspie AG,Harris RW,et al.Ratoon stunting disease of sugarcane:Isolation of the causal bacterium[J].Science,1980, 210(4476):1365-1367.

[2]McDougall WA,Steindl DRI,Elliott JT.Variations in primary vigour in the variety Q28[J].Cane Growers'Quarterly Bulletin,1948, 12:31-34.

[3]伍承芳，黃孟群.我國大陸發(fā)現(xiàn)甘蔗宿根矮化病[J].甘蔗糖業(yè)，1986（7）：29-30.

[4]James G.A review of ratoon stunting disease[J].International Sugar Journal,1996,98(1174):532-541.

[5]黃孟群，肖鎮(zhèn)杰.廣東甘蔗宿根矮化病調(diào)查報(bào)告[J].甘蔗糖業(yè)，1987（6）：39-40.

[6]李文鳳，羅志明，黃應(yīng)昆，等.云南雙江蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的調(diào)查及病原檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（4）：1309-1312.

[7]Pan Y B,Grisham M P,Burner D M,et al.A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease[J].Plant Disease,1998,82(3):285-290.

[8]沈萬寬，鄭學(xué)文，陳仲華，等.湛江農(nóng)墾蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病調(diào)查研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（4）：387-391.

[9]黃應(yīng)昆，李文鳳，趙俊，等.云南甘蔗宿根矮化病病原檢測[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22（5）：25-28.

[10]鄧展云，王伯輝，劉海斌，等.廣西甘蔗宿根矮化病的發(fā)生及病原檢測[J].中國糖料，2004（3）：35-38.

[11]盧文潔，李文鳳，黃應(yīng)昆，等.甘蔗溫水脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)與增產(chǎn)效能[J].中國糖料，2010（3）：52-53.

Pathogen Detection for Ratoon Stunting Disease of Main Sugarcane Cultivars

ZHANG Rong-yue,HUANG Ying-kun,LI Wen-feng,LUO Zhi-ming,SHEN Ke,WANG Xiao-yan,et al
(Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699,China)

Field samplings were carried out for RSD of main sugarcane cultivars in several main sugarcane planting areas of Yunnan and Guangxi province of China,and 393 samples from 20 main cultivars were collected to detect them by PCR for RSD.The results showed that 19 cultivars were positive to RSD from 20 cultivars, positive rate were about 9.23%-100%.234 samples were positive from 393 samples,the positive rate were 59.54%.This study showed that the RSD infection of major sugarcane cultivars was serious in the main sugarcane planting areas of Yunnan and Guangxi province.

sugarcane;ratoon stunting disease;main cultivars;pathogen detection

S435.661

A

1007-2624（2014）02-0026-02

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.009

2013-08-12

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-20-2-2）；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助。

張榮躍（1982-），男，研究實(shí)習(xí)員，主要從事甘蔗病害研究。E-mail：rongyuezhang@hotmail.com。

黃應(yīng)昆（1964-），男，研究員，主要從事甘蔗病蟲害防治研究。E-mail：huangyk64@163.com。