董 嬌，周 軍，辛培堯，唐軍榮，陶 磅，原曉龍，孟富宣

(1.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明650224；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 園藝作物研究所，云南 昆明 650205)

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)廣泛存在于植物中，催化L-丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，在苯丙氨酸代謝途徑中，它既是一種限速酶，也是一種誘導(dǎo)酶[1]。PAL在初生代謝和苯丙烷類代謝途徑中起紐帶作用[2]。PAL由4個亞基組成，由多基因家族編碼，在這個多基因家族中，不同成員的表達特異性不同。不同植物中PAL基因的核苷酸序列與其編碼的氨基酸序列的相似性較高，該基因家族可能起源于一個古老的基因，基因的復(fù)制和分子上的歧異可能會形成功能不同的基因，以應(yīng)對不同環(huán)境因素的影響，分別在不同組織和發(fā)育時期表達[3]。有關(guān)研究結(jié)果表明，PAL與類黃酮、木質(zhì)素和香豆素等次生代謝途徑密切相關(guān)[4-7]。Koukol等人[8]首次從植物中發(fā)現(xiàn)并分離純化了該酶。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及分離純化技術(shù)的不斷完善，對PAL的研究已迅速展開，目前已成功地從水稻、小麥、馬鈴薯、松樹、豌豆等種植物中分離純化得到PAL基因[9]。

巍山紅雪梨是云南特有的紅皮梨，筆者利用特異性引物對巍山紅雪梨的PAL基因片段進行了同源克隆，并利用生物軟件對該基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)進行了生物信息學(xué)分析，以期為調(diào)控巍山紅雪梨類黃酮的積累及增強巍山紅雪梨對不良環(huán)境的抵御能力的深入研究而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

巍山紅雪梨栽培于云南省安寧市清水河紅皮梨種質(zhì)基地，于2011年3月采集幼葉，經(jīng)液氮處理后，保存于-80℃的冰箱中以備用。

1.1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Quantscript RT Kit)、DNA割膠回收試劑盒、2× Taq PCR MasterMix Kit與DL marker 2000，均購自天根生物技術(shù)有限公司；常規(guī)化學(xué)藥品及試劑，購自Sigma公司或國產(chǎn)AR級試劑；PCR和測序引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；測序由北京中美泰和有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的抽提與cDNA第一鏈的合成

RNA的提取：①取供試材料0.5～1.0g置于液氮中研磨成粉末，并快速將其轉(zhuǎn)移到事先預(yù)冷的離心管中；②加入65℃預(yù)熱的CTAB緩沖液 750μL 和β-巰基乙醇 60μL，于 65℃下處理5min，冷至室溫再加入乙酸鉀500μL，搖勻，于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min；③取上清液置于新管中，加入300μL的飽和酚，再加入24∶1的氯仿/異戊醇300μL，搖勻，于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min；④取上清液置于新管中，加入24∶1的氯仿/異戊醇600μL，搖勻，于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min；⑤取上清液置于新管中，加入體積分數(shù)為1/4的LiCl 4 mol/L，混勻，在4℃下沉淀過夜；⑥于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，去上清液，用500μL的SSTE溶解沉淀后，加入水飽和酚250μL和24∶1的氯仿/異戊醇250μL，搖勻，于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min；⑦取上清液置于新管中，加入24∶1的氯仿/異戊醇500μL，搖勻，于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min；⑧取上清液置于另一新管中，加入無水乙醇1 000μL，于-80℃下沉淀30min；⑨于4℃下以12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液，用75％乙醇清洗沉淀物1次，在超凈工作臺上無菌風干燥至少15min，然后加入經(jīng)滅菌處理過的DEPC水30μL溶解沉淀物，于-80℃的冰箱中保存以備用。

總RNA質(zhì)量檢測：取2μL的總RNA，用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

紫外分光光度計定量測定和純度分析：取2μL RNA 樣品稀釋50倍，用紫外分光光度計測定230、260和280nm波長下的OD值，記錄RNA濃度和OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm的值，以確定提取的巍山紅雪梨的純度。

cDNA第一條鏈的合成：①在冰浴的無核酸酶的離心管中依次加入1～5μg總RNA、2μL Oligo(dT)15、2μL dNTP(2.5 mM each)等 反應(yīng)混合物，補RNase-free ddH2O定容至14.5μL；②于70℃下加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，簡短離心收集反應(yīng)液后加入5×First-Strand Buffer(含有DTT)4μL和RNasin 0.5μL；③加入1μL(200 U)TIANScript M-MLV，輕輕地用移液器混勻；④于42℃下溫浴50min；④于95℃下加熱5min，終止反應(yīng)，置之于冰上進行后續(xù)實驗，或于-20℃下冷凍以保存；⑥用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μL，取2～5μL進行PCR擴增反應(yīng)。

1.2.2 巍山紅雪梨PAL基因的克隆

引物設(shè)計：對GenBank上已經(jīng)登錄的梨PAL同源基因的多個序列進行比對，設(shè)計了3對特異性引物，引物序列分別如下。

PAL(F1)：5’-CAGAACGGTGCTGTGGAGTC-3’；

PAL(R1)：5’-GTGCTTCAACTTGTGCGTCA-3’；

PAL(F2)：5’-TGGCATCTTATTGTTCCG-3’；

PAL(R2)：5’-TTGGCTCACCGTGTTCTT-3’；

PAL(F3)：5’-CACGGTGAGCCAAGTCG-3’；

PAL(R3)：5’-GCATTCCGCAATCCTGT-3’。

PCR反應(yīng)體系：以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進行PCR擴增，其反應(yīng)體系為cDNA模板2μL、2×PCR Master Mix 25μL、PAL(F)2μL、PAL(R)2μL、以 ddH2O 補足 50μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃，預(yù)變性2min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min；35 個循環(huán)；72℃，延伸 7min。

反應(yīng)結(jié)束后，以1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將樣品送至北京中美泰和有限公司進行測序。

1.2.3 巍山紅雪梨PAL基因序列的生物信息學(xué)分析

測序由北京中美泰和有限公司完成。利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.cbs.dtu.dk/、http://www.expasy.org/等網(wǎng)站提供的各類生物信息學(xué)軟件進行在線分析。在NCBI-ORF Finder上進行開放閱讀框(Open reading frame，ORF)的查找和翻譯；利用ProtParam在線工具分析CHS的核酸及氨基酸序列的組成成分及其理化性質(zhì)；利用MEGA4.0[10]完成氨基酸序列的同源性比對及進化樹的構(gòu)建；分別利用TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 和ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/ protscale.html)等在線工具進行蛋白質(zhì)導(dǎo)肽與信號肽的預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)域及親水性/疏水性的預(yù)測；分別利 用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)、Swiss-Model(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISSMODEL.html)在線工具和NCBI提供的Conserved Domain Search(CD-Search)服務(wù)器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及蛋白質(zhì)功能域的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL基因序列及其所推導(dǎo)的氨基酸序列的比對分析

經(jīng)PCR擴增后，獲得了3個片段，測序后將此3個序列進行拼接，獲得了如圖1所示的cDNA片段，該片段長為1 919 bp，編碼628個氨基酸。將此序列進行比對分析，結(jié)果表明：其與西洋梨的PAL基因(DQ230992)、鴨梨Pyrus bretschneideri的PAL基因(GU906268、JQ247318)在核苷酸水平上的同源性分別為98％和95％、95％；其與甜櫻桃Prunus avium的PAL基因(AF036948)、覆盆子Rubus idaeus的PAL基因(AF237955)、桑樹Morus alba的PAL基因(HM064433)、荔枝Litchi chinensis的PAL基因(FJ944018)、葡萄的PAL基因(EF192469)和木薯Manihot esculenta的PAL基因(AY036011)的同源性分別為88％、83％、82％、80％、79％與78％。這一比對結(jié)果可以初步說明，PAL是苯丙氨酸解氨酶基因，名之為PpPAL，將此序列提交至GenBank，序列號為JQ749640。

根據(jù)巍山紅雪梨PAL基因編碼的氨基酸序列與已知的PAL基因的氨基酸序列，用Clustal W軟件進行比對后，再用MEGA4.0軟件采用NJ法作出它們的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2A與B所示。從圖2A中可以看出，巍山紅雪梨的PAL蛋白與鴨梨(ADF59061、AEZ01784)、西洋梨(ABB70117)、甜櫻桃(AAC78457)、覆盆子(AAF40224)、桑樹(ADI40166)、荔枝(ACR15762)、葡萄(ABM67591)、木薯(AAK62030)、擬南芥(NP_001190223)的PAL蛋白聚在雙子葉植物這一大類群中。在這個大類群中，同屬植物巍山紅雪梨、西洋梨和鴨梨都聚在一個亞類上，這說明它們的親緣關(guān)系較近，這與從分類學(xué)上分析的結(jié)論相符；擬南芥的PAL蛋白和巍山紅雪梨的PAL蛋白雖然聚在這個大類群中，但擬南芥在這個類群的外側(cè)，說明二者在進化上的親緣關(guān)系較遠；單子葉植物玉米(NP_001241797)和水稻(AAO72666)聚為一類，說明它們的親緣關(guān)系較近，但巍山紅雪梨的PAL蛋白與它們之間在進化上的關(guān)系較遠。分析序列比對結(jié)果后可以發(fā)現(xiàn)，此PAL序列包含了L180、V181、L230、A231等脫氨基氨基酸殘基，其催化活性位點分別為N234、G235、N356、D357、N358、H370、HNQDV(460～464)，這些活性位點與有關(guān)研究報道的水稻、玉米、夾竹桃、銀杏的相同，說明PpPAL是PAL蛋白質(zhì)家族成員之一。

2.2 PAL蛋白的理化性質(zhì)

采用ProtParam在線軟件分析PAL蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：PAL基因編碼的蛋白質(zhì)的預(yù)測分子量為68 KDa，理論等電點為6.42，其中Leu、Ala、Ser、Val等是其主要的氨基酸；負電荷殘基(Asp＋Glu)總數(shù)為66個，正電荷殘基(Arg＋Lys)總數(shù)為61個，不穩(wěn)定系數(shù)為33.58，單條肽鏈屬于穩(wěn)定蛋白。

圖1 巍山紅雪梨PAL基因的核苷酸序列及由其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Full-length sequences of PpPAL cDNA in Pyrus pyrifolia and its deduced amino acid sequence

A 巍山紅雪梨的PAL蛋白與其它植物的PAL蛋白的進化關(guān)系A(chǔ) Evolutionary relationship of deduced PpPAL protein with PAL proteins from other plants

B 不同植物PAL蛋白的進化關(guān)系B Evolutionary relationship of PAL proteins in different plants

2.3 巍山紅雪梨PAL蛋白的亞細胞定位、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和疏水性分析

采用Target 1.1 Server在線軟件對PAL蛋白質(zhì)亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果顯示：該蛋白質(zhì)可能定位于細胞質(zhì)基質(zhì)，預(yù)測的可靠性等級為2級(詳見表1)，而與之同源性較高的其它植物(包括西洋梨、鴨梨等)的PAL基因也定位在細胞質(zhì)基質(zhì)上，相同的亞細胞定位說明這些基因可能具有相似的功能。

表1 巍山紅雪梨PAL蛋白的亞細胞定位Table 1 PAL protein subcellular localization prediction of ‘Weishan’red skin pear (Pyrus pyrifolia Naki)

利用SignalP4.0 Server軟件進行在線分析，結(jié)果也表明，巍山紅雪梨的PAL基因編碼的蛋白質(zhì)無信號肽?？梢?，巍山紅雪梨的PAL蛋白在游離核糖體上起始合成后，很可能沒有進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，而是繼續(xù)保留在細胞質(zhì)基質(zhì)中催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸。

利用TMHMM 2.0 Server軟件對巍山紅雪梨PAL氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行在線預(yù)測，結(jié)果表明，PAL整條肽鏈都位于細胞膜外，說明巍山紅雪梨的PAL基因編碼的多肽不存在跨膜區(qū)，結(jié)合上述轉(zhuǎn)運肽的預(yù)測結(jié)果可以推測出，巍山紅雪梨的PAL在細胞質(zhì)基質(zhì)中合成后很可能不經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)運便直接錨定于細胞質(zhì)基質(zhì)中的特定部位而行使催化功能。

利用ProtScale軟件對巍山紅雪梨的PAL氨基酸序列的疏水性/親水性進行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。圖3的預(yù)測結(jié)果表明，多肽鏈第322位具有最低分值-2.656，說明其親水性最強；第256位具有最高分值(2.700)，說明其疏水性最強。而就其整體而言，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，而且多于疏水性氨基酸。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，沒有明顯的疏水區(qū)域。結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果可以推斷，巍山紅雪梨的PAL基因編碼的多肽不存在明顯的疏水區(qū)域，這與PAL不存在跨膜區(qū)的特征相吻合。因此認為，巍山紅雪梨的PAL是親水性蛋白。

圖3 巍山紅雪梨PAL的疏水性/親水性的預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction of hydrophobicity or hydrophilicity of PAL in Pyrus pyrifolia

2.4 巍山紅雪梨PAL蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析

利用SOPMA軟件對巍山紅雪梨的PAL氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖4(見封二)所示。圖4表明，巍山紅雪梨的PAL基因所編碼的蛋白由57.39％的α-螺旋(Alpha helix)、7.79％的β-折疊(Extended strand)、4.61％的β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和30.21％的隨機卷曲(Random coil)組成。α-螺旋和無規(guī)則卷曲是巍山紅雪梨PAL蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個蛋白序列中。

采用SWISS-MODEL同源建模的方法預(yù)測巍山紅雪梨PAL蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5(見封二)所示。再利用ProCheck軟件對建模結(jié)果進行檢測，計算得出了如圖6(見封二)所示的Ramachandran 圖。圖6表明，檢測到的巍山紅雪梨PAL蛋白質(zhì)殘基的二面角只有87.7％位于黃色區(qū)域，表明其空間結(jié)構(gòu)可能不夠穩(wěn)定。

2.5 巍山紅雪梨PAL蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析

使用NCBI提供的Conserved Domain Search service(CD-Search)對巍山紅雪梨PAL蛋白功能域進行預(yù)測，結(jié)果如圖7(見封二)所示。圖7表明，該蛋白含有苯丙氨酸解氨酶-組氨酸解氨酶(PAL-HAL)和苯丙氨酸解氨酶(phe_am_lyase)，它們都屬于類裂解酶超家族(Lyase_I_like superfamily)，在β-消除反應(yīng)中起催化作用。

3 討 論

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷類代謝中的第一個酶。Neish早在1960年就證實了PAL催化花色素苷的合成[11]。此外，它在類黃酮、木質(zhì)素、香豆素、水楊酸、單寧等次生代謝產(chǎn)物合成過程中也起著很重要的作用。這些次生物質(zhì)對植物生長發(fā)育、抗病害、防御紫外線等方面都有幫助。近年來，有關(guān)PAL基因的研究也成為了相關(guān)研究的熱點。

本研究從云南特有紅皮梨品種——巍山紅雪梨中克隆了PAL基因的cDNA片段，核苷酸與氨基酸序列分析結(jié)果表明，該基因與其它植物的PAL基因有著很高的同源性，并且含有相似的蛋白質(zhì)保守活性位點。在PpPAL蛋白序列中包含L180、V181、L230、A231等脫氨基氨基酸殘基，其催化活性位點分別為N234、G235、N356、D357、N358、H370、HNQDV(460-464)，這些活性位點與對水稻[12]、玉米[13]、夾竹桃[14]等研究報道的結(jié)果相同。對PAL的聚類分析結(jié)果顯示，巍山紅雪梨與西洋梨、鴨梨的關(guān)系最近，處于同一分支，而與十字花科的擬南芥的進化關(guān)系稍遠，與單子葉植物玉米、水稻的親緣關(guān)系最遠。本試驗雖然只得到了PAL基因的片段，但克隆的基因具有代表性，為進一步克隆巍山紅雪梨PAL基因全長奠定了基礎(chǔ)[15]。

開展植物花色素苷合成調(diào)控機制的研究，除了利用模式植物，在一些如巍山紅雪梨的木本植物中同樣有利于揭示植物次生代謝途徑在類黃酮積累中的調(diào)控規(guī)律。本研究結(jié)果可為紅皮梨類黃酮類化合物代謝的分子調(diào)控機制及增強巍山紅雪梨對不良環(huán)境的抵御能力的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

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