李鐵柱，杜紅巖，劉慧敏

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004)

杜仲是我國傳統(tǒng)中藥材[1-3]，杜仲組織和器官中有11種苯丙素類化合物被發(fā)現(xiàn)，包括：綠原酸、咖啡酸、香草酸、松柏酸、間羥基苯丙酸、松柏苷、丁香苷、寇布拉苷、愈創(chuàng)木丙三醇、綠原酸甲酯、咖啡酸乙酯[4-9]。

苯丙素類化合物在植物體內(nèi)生物合成，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是這一過程中的第1個(gè)關(guān)鍵酶，該酶催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸,再由反式肉桂酸生成芥子酸、阿魏酸、香豆酸等，在其它酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素類、黃酮類和酚類等次生代謝產(chǎn)物[10]。PAL基因一般都含有多個(gè)基因家族，PAL亞基又包括2～5個(gè)基因的小的多基因家族編碼，隨植物不同而不同[11-15]，如松樹PAL僅有1個(gè)PAL基因，菜豆有3個(gè)PAL基因：PAL1、PAL2、PAL3，歐芹和煙草的PAL基因有 4 個(gè)，番茄則有5個(gè)PAL基因，水稻有11個(gè)PAL基因，而馬鈴薯的PAL基因就更多，估計(jì)達(dá)到40～50個(gè)之多。PAL多基因家族中，各家族成員的表達(dá)活性并不相同，PAL基因是否表達(dá)及表達(dá)量的相對多少都受植物發(fā)育階段和環(huán)境信號的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為嚴(yán)格的組織和發(fā)育特異性[16-19]。文中對杜仲PAL基因cDNA和基因組全長序列特征進(jìn)行系統(tǒng)的分析，旨在為杜仲苯丙素類高效合成的分子調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心采集杜仲優(yōu)良品種“華仲6號”的葉片和果實(shí)，提取RNA，送至深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和基因功能注釋[20-21]。轉(zhuǎn)錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具，和其它物種已知的CDS序列進(jìn)行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉(zhuǎn)錄組中的待分析基因。

利用 ExPASyProtParam(http://cn.expasy.org)程序與ScanProsite程序?qū)uPAL基因氨基酸殘基數(shù)目、氨基酸組成比例、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)以及蛋白質(zhì)的親水疏水性等性能參數(shù)進(jìn)行預(yù)測與分析；利用GOR4程序(http:// bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預(yù)測EuPAL編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)程序，根據(jù)基因氨基酸序列，在PBD(Protein data bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)數(shù)據(jù)庫搜索相似序列，采用alignment mode建模的方式進(jìn)行同源建模，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；用MEGA軟件進(jìn)行遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建EuPAL系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuPAL基因與其它植物種的相似性

EuPAL1(Unigene9151)氨基酸序列與長春 花Catharanthus roseus(BAA95629.1)、煙 草Nicotiana tabacum(BAA22948.1)、 香芹Petroselinum crispum(CAA57057.1)、胡蘿卜Daucus carota(BAC56977.1)、蓖 麻Ricinus communis(XP_002519521.1)等物種的苯丙氨酸脫氨酶氨基酸序列的相似性分別為88％、86％、87％、87％、87％，見圖 1。EuPAL1全長cDNA長度為2 133 bp，編碼 711個(gè)氨基酸。

圖1 EuPAL全長氨基酸序列與同源序列的多重比對Fig.1 Multiple alignment of full length amino acid sequence of EuPAL and homologous sequences

另外，EuPAL2(Unigene18458)的氨基酸序列與紫背天葵Gynura bicolor(BAJ17655.1)、葡 萄(XP_002285277.1)、萵 苣Lactuca sativa(AF299330_1)、金光菊Rudbeckia hirta(ABN79671.2)、木薯Manihot esculenta(AAK62030.1)的PAL氨基酸序列的相似性分別為83％、84％、83％、83％、82％，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中未得到全長cDNA序列，但與EuPAL1的氨基酸序列具有較高的相似性。

2.2 EuPAL編碼蛋白質(zhì)的理化特性

ExPaSy ProtParam軟件預(yù)測EuPAL酶蛋白的氨基酸組成中以亮氨酸(11.0％)、丙氨酸(9.4％)、甘氨酸(8.7％)含量為最高，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為77.14kD，理論等電點(diǎn)為6.24，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.25，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 EuPAL編碼蛋白的親水/疏水性分析

Expasy Protscale程序分析EuPAL編碼蛋白的親水性/疏水性，結(jié)果如圖2所示。EuPAL編碼蛋白氨基酸殘基中以A116親水性最強(qiáng)(-1.074)，以A696疏水性最強(qiáng)(1.502)，親水氨基酸殘基的數(shù)量的數(shù)量小于疏水氨基酸殘基數(shù)量，故推斷EuPAL編碼蛋白為疏水性蛋白質(zhì)。

2.4 EuPAL編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

用GOR4軟件在線預(yù)測EuPAL基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋占44.30％，β-折疊占8.72％，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占46.98％，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(見圖3)。

蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果見圖4，EuPAL為多結(jié)構(gòu)域蛋白，屬Lyase-I-Like超家族。

2.5 EuPAL編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用Alignment Mode的方式對杜仲PAL基因編碼蛋白進(jìn)行同源建模。經(jīng)PBD(Protein data bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 數(shù)據(jù)庫搜索，發(fā)現(xiàn)與18 458號基因序列一樣，與香菜Petroselinum crispum苯丙氨酸氨脫氨酶晶體結(jié)構(gòu)有較高的同源性，也可能涉及杜仲苯丙烷代謝途徑，在PBD編號為1W27(DOI：10.221 0/pdb1W27/pdb)，以此為模板進(jìn)行同源性建模，獲得的蛋白模型QMEAN 得分為0.100(見圖5)。

圖2 EuPAL蛋白的親水/疏水性預(yù)測Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of the deduced EuPAL protein

圖3 EuPAL蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of the deduced EuPAL protein

圖4 EuPAL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Prediction of conserved domains of the deduced EuPAL protein

2.6 PAL基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 EuPAL蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure of the deduced EuPAL protein

系統(tǒng)發(fā)育樹表明，EuPAL1和EuPAL2基因?qū)儆诓煌悇e(見圖6和圖7)。EuPAL1序列優(yōu)先與芭蕉、山茶、咖啡等的PAL蛋白聚在一起。推測EuPAL基因很可能還參與到杜仲苯丙素類化合物代謝途徑，從而影響杜仲的生長發(fā)育。

圖6 PAL同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of PAL homologous proteins

圖7 EuPAL1和EuPAL2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 EuPAL1 and EuPAL2 phylogenetic tree

3 結(jié)論與討論

杜仲苯丙氨酸脫氨酶基因(PAL)是槲皮素合成途徑中的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了1條PAL基因全長cDNA，命名為EuPAL1，EuPAL1全長cDNA長度為2 133 bp，編碼 711個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為77.14kD，理論等電點(diǎn)為6.24；EuPAL1的氨基酸組成中甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸含量較高，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主的混合結(jié)構(gòu)，屬于lyase-I-like蛋白質(zhì)超家族。

綠原酸是重要的苯丙素類化合物之一，是杜仲重要的藥理功效生物活性成分，受到普遍關(guān)注，具有廣泛的生理活性，具有消炎抗菌以及興奮中樞神經(jīng)等多種作用，對消化、生殖系統(tǒng)疾病均具顯著療效。葡萄糖在酶的催化下轉(zhuǎn)化成莽草酸，后者再轉(zhuǎn)化成苯丙氨酸，最后經(jīng)合成酶的作用得到綠原酸，其中苯丙氨酸脫氨酶基因(PAL)為關(guān)鍵酶基因之一。不同植物中PAL基因存在豐富的變異[22-23]，PAL的相對分子質(zhì)量為55～88kD，分布于細(xì)胞質(zhì)和一些膜細(xì)胞器中，如葉綠體、白色體、線粒體、過氧化物體。不同來源的PAL相對分子質(zhì)量不同，一般介于220～330kD。PAL多基因家族一般均含有2～3個(gè)家族成員。PAL基因是一個(gè)比較保守的基因，該基因在不同植物種編碼區(qū)變化范圍不大，PAL基因編碼區(qū)一般在2 100 bp左右，但存在一些差異，同一植物多基因家族中的各個(gè)基因編碼長度也不盡相同，PAL在植物次生代謝方面起重要作用，擬南芥、豌豆、松樹楊樹、水稻、煙草、茶樹的PAL基因已被克隆，結(jié)果表明，在多數(shù)植物中PAL基因以基因家族形式存在，但在不同植物中家族成員數(shù)量變化較大，如楊樹至少有2個(gè)、菜豆3個(gè)、歐芹4個(gè)、茶樹1個(gè)、馬鈴薯40多個(gè)[24]。從杜仲幼果和成熟葉片中鑒定PAL基因，發(fā)現(xiàn)至少存在12個(gè)家族成員，說明杜仲該基因的遺傳多樣性非常高，超過一般植物，這可能與杜仲除了木質(zhì)素外，還富含苯丙素、黃酮類等活性成分密切相關(guān)。

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