李鐵柱，杜紅巖，王 淋

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國(guó)家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

杜仲是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，葉片和果實(shí)中含有大量的綠原酸等活性成分[1-5]，肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamic Acid 4-Hydroxylase，C4H)，是綠原酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[6]。

肉桂酸-4-羥化酶也叫苯乙烯酸4-脫氫酶，C4H分布在微粒體中，能夠原位利用PAL催化產(chǎn)生的苯乙烯酸。C4H是細(xì)胞色素單加氧酶P450超家族的成員之一，該酶由Russell和Conn首次從豌豆芽中發(fā)現(xiàn)[7]，它是苯丙素類化合物生物合成途徑里繼PAL(苯丙氨酸脫氨酶)之后的第2個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[8-9]。擬南芥的C4H為單一位點(diǎn)編碼，基因啟動(dòng)子在PAL和4CL基因中的順式作用組分也有保留，它控制著對(duì)紫外線照射、光和elicitor激活因子處理反應(yīng)，C4H基因編碼的mRNA以及蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)是嚴(yán)格與苯丙氨酸脫氨酶的 mRNA和蛋白質(zhì)同步調(diào)節(jié)的，以此普遍認(rèn)為肉桂酸-4-羥化酶是苯丙素類物質(zhì)代謝中一個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)。由于肉桂酸-4-羥化酶基因在植物次生代謝中有這些重要的作用，因此受到關(guān)廣泛關(guān)注。自從上世紀(jì)80年代以來(lái)，肉桂酸-4-羥化酶基因的克隆漸漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。 迄今，已有多種植物的C4H基因被分離出來(lái)[10-11]。和苯丙氨酸脫氨酶基因類似，肉桂酸-4-羥化酶基因的拷貝數(shù)在不同植物之間存在差異。比如苜蓿C4H基因有2個(gè)拷貝，豌豆Pisumsal sativum的C4H基因只有一個(gè)拷貝，綠豆和長(zhǎng)春花的C4H基因家族都有多個(gè)成員。這些不同植物種的C4H基因所編碼的氨基酸序列相似性極高，同源性普遍在85％左右。但玉米和法國(guó)菜豆的2個(gè)C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60％[12]。

文中對(duì)C4H基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，旨在為杜仲綠原酸等活性成分合成的分子調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心采集杜仲優(yōu)良品種“華仲6號(hào)”的葉片和果實(shí)，提取RNA，送至深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因功能注釋[13-14]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的Unigene，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具，與其它物種已知的CDS序列進(jìn)行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉(zhuǎn)錄組中的待分析基因。確定基因后，分析該基因(或基因家族)在杜仲葉片和果實(shí)中的表達(dá)量，推斷該基因在杜仲活性成分生物合成中的地位和作用。對(duì)杜仲膠合成時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋和杜仲基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列生物學(xué)分析。利用 ExPASyProtParam(http://cn.Expasy.org)程序與ScanProsite程序?qū)Χ胖貱4H家族各成員的氨基酸殘基數(shù)目、氨基酸殘基組成比例、基因編碼蛋白質(zhì)的分子量、理論等電點(diǎn)以及編碼蛋白質(zhì)的親疏水性等性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析；利用GOR4程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預(yù)測(cè)EuC4H蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用 Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)程序，根據(jù)基因氨基酸序列，在PBD(Protein data bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索相似序列， 采用alignment mode建模的方式進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)EuC4H蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；用MEGA軟件進(jìn)行遺傳系統(tǒng)分析，構(gòu)建EuC4H系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuC4H基因與其它植物種序列相似性

EuC4H1(Unigene9197)氨基酸序列與川椒Capsicum annuum(ACF19421.1)、 紫 草Lithospermum erythrorhizon(BAB71716.1)、 馬鈴薯Solanum tuberosum(ABC69046.1)、懸鉤子Rubus occidentalis(ACM17896.1)、丹參Salvia miltiorrhiza(ABC75596.1)的C4H氨基酸序列的相似性分別為90％、90％、91％、89％、89％(見圖1)。將EuC4H1基因cDNA全長(zhǎng)序列命名為EuC4H1。其cDNA全長(zhǎng)為1 641 bp，編碼547個(gè)氨基酸。

另外，EuC4H2基因Unigene21793的氨基酸序列與楊樹(XP_002331408.1)、煙草(AAK62344.1)、葡萄(XP_002266037.1)、人參(AEY75219.1)、甜橙(AF255013_1)C4H氨基酸序列的相似性分別為77％、77％、79％、78％、76％，EuC4H2全長(zhǎng)為1 611 bp，編碼537個(gè)aa。

2.2 EuC4H編碼蛋白的理化特性

用ExPaSy ProtParam程序預(yù)測(cè)EuC4H1和EuC4H2編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為62.94kD和60.96kD，理論等電點(diǎn)為9.34和8.85；氨基酸組成中都以亮氨酸、精氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量最高，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)分別為49.91和49.67，均屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。TargetP 1.1 Server工具推斷EuC4H1和EuC4H2編碼蛋白都屬分泌蛋白，分值為0.840，可靠性為3級(jí)。

2.3 EuC4H編碼蛋白的親水/疏水性分析

用Expasy Protscale程序分析杜仲C4H1和EuC4H2的編碼蛋白疏水/親水性，結(jié)果如圖2所示，EuC4H1蛋白氨基酸殘基中分別以A56和A45疏水性最強(qiáng)(1.971和2.049)，分別以A307、A276親水性最強(qiáng)(-0.996和-0.933)，親水氨基酸的數(shù)量小于疏水氨基酸，故推斷2個(gè)EuC4H編碼蛋白均為疏水性蛋白。

2.4 EuC4H編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

以GOR4程序預(yù)測(cè)EuC4H1和EuC4H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋分別占46.07％和37.80％，β-折疊占15.36％和16.76％，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占38.57％和45.44％，兩者均屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(見圖3和圖4)。

圖1 EuC4H全長(zhǎng)cDNA氨基酸序列與同源序列的多重比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of full length amino acid sequence of EuC4H and homologous sequences

圖2 EuC4H1和EuC4H2蛋白的親水/疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of EuC4H1and EuC4H2 proteins

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果見圖5和6，EuC4H基因編碼蛋白為多結(jié)構(gòu)域蛋白，屬Cypx超家族。

2.5 EuC4H編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

采用自動(dòng)建模的方式對(duì)EuC4H1蛋白進(jìn)行同源建模(見圖7A)。以人的細(xì)胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)為模板，蛋白模型QMEAN 得分為0.522，與人的細(xì)胞色素P450 2D6的相似性為23.27％[15-18]。

采用自動(dòng)建模的方式對(duì)EuC4H2蛋白進(jìn)行同源建模(見圖7B)。以人的細(xì)胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)為模板，蛋白模型QMEAN 得分為0.516，與人的細(xì)胞色素P450 2D6的相似性為22.50％。

圖4 EuC4H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary structure of the deduced EuC4H2 protein

圖5 EuC4H1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H1 protein

圖6 EuC4H2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H2 protein

圖7 EuC4H蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of tertiary structure of the deduced EuC4H protein

2.6 C4H基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)是苯丙烷類代謝途徑的第1個(gè)羥基化酶，是一種與細(xì)胞色素P450密切相關(guān)的單氧化酶，C4H能利用PAL產(chǎn)物肉桂酸形成對(duì)-羥基香豆酸[19]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明：杜仲中分離的基因序列也與煙草、紫草、矮牽牛的C4H蛋白聚在一起(見圖8和圖9)，說明EuC4H很可能是杜仲苯丙素類物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因，影響杜仲木質(zhì)素的合成代謝。

圖8 C4H同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of C4H homologous proteins

圖9 EuC4H系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 EuC4H phylogenetic tree

3 結(jié)論與討論

杜仲肉桂酸-4-羥化酶(EuC4H)，其cDNA全長(zhǎng)為1 641 bp，編碼547個(gè)氨基酸，EuC4H相對(duì)分子質(zhì)量為62.94kD，理論等電點(diǎn)為9.34；氨基酸以亮氨酸、精氨酸、纈氨酸的含量較高，疏水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；EuC4H二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占46.07％，β-折疊占15.36％，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占38.57％，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，屬Cypx超家族。

肉桂酸-4-羥化酶(C4H)基因相對(duì)而言，以小基因家族存在，遺傳多樣性低，保守性較高的基因，如EuC4H基因與川椒Capsicum annuumACF19421.1、 紫 草Lithospermum erythrorhizonBAB71716.1、 馬 鈴 薯Solanum tuberosumABC69046.1的氨基酸序列相似性高達(dá)90％以上。本研究在轉(zhuǎn)錄組研究的基礎(chǔ)上，從杜仲果實(shí)和葉片中分離鑒定了2種C4H基因。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，肉桂酸-4-羥化酶的表達(dá)與植物的木質(zhì)化進(jìn)程關(guān)系密切[20]。研究歐芹肉桂酸-4-羥化酶表達(dá)模式顯示，C4H基因在木質(zhì)化程度高的花梗中表達(dá)豐富，但在幼嫩葉片和成熟葉片中均不表達(dá)[21]；擬南芥的肉桂酸-4-羥化酶基因也在木質(zhì)化的細(xì)胞中表達(dá)量最為豐富[22]，對(duì)肉桂酸-4-羥化酶功能系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育各階段或者各種外界因子如機(jī)械損傷、真菌感染以及化學(xué)誘導(dǎo)、激發(fā)子等的刺激下，肉桂酸-4-羥化酶基因編碼的mRNA積累水平和變化趨勢(shì)與苯丙氨酸脫氨酶趨于一致。因此，下一步應(yīng)開展杜仲C4H基因?qū)G原酸生物積累的貢獻(xiàn)方面的系統(tǒng)研究，為C4H基因的分子調(diào)控機(jī)理研究提供依據(jù)。

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