王 強(qiáng)，李貴節(jié)，趙 欣，任彥榮

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的制備及體內(nèi)外抗氧化活性研究

王 強(qiáng)，李貴節(jié)，趙 欣，任彥榮

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

采用木瓜蛋白酶酶解羅非魚(yú)肉蛋白，通過(guò)測(cè)定不同劑量羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的還原力，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、·OH和O2－·清除率及對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化作用，評(píng)價(jià)羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的體內(nèi)外抗氧化特性。結(jié)果表明：羅非魚(yú)肉蛋白酶解液具有較高的還原力，清除DPPH自由基、·OH和O2－·的半數(shù)有效質(zhì)量濃度分別為1.57、1.68 mg/mL和2.76 mg/mL；羅非魚(yú)肉蛋白酶解液能顯著提高小鼠血清和肝臟組織中超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力和總抗氧化能力（P＜0.05），同時(shí)使血清和肝臟組織中的丙二醛含量顯著降低（P＜0.05）。羅非魚(yú)肉蛋白酶解液有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗氧化活性。

羅非魚(yú)肉；酶解液；體外抗氧化活性；D-半乳糖衰老模型小鼠

在生物氧化代謝過(guò)程中，會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基，而自由基過(guò)多與體內(nèi)多種功能性障礙和疾病發(fā)生有關(guān)，是引起機(jī)體衰老根本原因，也是誘發(fā)腫瘤、癌癥等惡性疾病的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性肽通過(guò)減少自由基，阻斷脂質(zhì)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而達(dá)到抗氧化、延緩衰老的作用[2-3]。其中動(dòng)物源抗氧化肽如沙丁魚(yú)抗氧化肽[4]、雞胸抗氧化肽[5]、紫貽貝抗氧化肽[6]、鹿肉抗氧化肽[7]等，在體外有較強(qiáng)的抗氧化活性，有的在體內(nèi)也有抗氧化的效果。蛋白質(zhì)酶解液是生物活性肽的主要來(lái)源，這些生物活性肽具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和降血壓等作用[1,8-9]。

羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）又稱非洲鯽魚(yú)，屬鱸形目、鱺魚(yú)科，具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)好、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。我國(guó)是世界上最大的羅非魚(yú)生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)量約占世界年產(chǎn)總量的一半[10]。羅非魚(yú)肉蛋白酶解液中含有較豐富的多肽和氨基酸，盡管近年來(lái)已有羅非魚(yú)酶解液抗氧化特性的相關(guān)報(bào)道[11-12]，但僅限于研究體外，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、·OH等自由基的抗氧化性未見(jiàn)有關(guān)其在體內(nèi)抗氧化特性的報(bào)道。為此，本研究采用木瓜蛋白酶，制備羅非魚(yú)肉蛋白酶解液，研究羅非魚(yú)肉蛋白酶解液在體內(nèi)外的抗氧化特性，以期為羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物、試劑與儀器

羅非魚(yú)購(gòu)于附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，取羅非魚(yú)肉，絞碎，放置于聚乙烯袋內(nèi)于－18 ℃凍藏備用。

昆明種小鼠50只，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)。

木瓜蛋白酶、D P P H、D-半乳糖 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用其他溶液均自行配制。

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天科貿(mào)有限公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將羅非魚(yú)肉50 g與蒸餾水100 mL混合勻漿，按質(zhì)量比1.5∶1 000加入木瓜蛋白酶，在52 ℃、pH 6.5條件下酶解6 h，置沸水中滅酶15 min，冷后于4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行抽濾，濾液即為實(shí)驗(yàn)所用的酶解液。

1.2.2 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1 還原力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法，在具塞比色管中加入0.2mol/L、pH 6.6的磷酸緩沖液2 mL、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）0.2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，50 ℃水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液2 mL，3 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混勻后室溫放置10 min，測(cè)定A700nm。

1.2.2.2 清除DPPH自由基的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，將DPPH溶液2 mL（10–4mol/L， 95%乙醇）與不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）的樣品溶液2 mL混勻后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度（Ai），同時(shí)，將DPPH溶液2 mL與樣品空白2 mL混勻后測(cè)定吸光度（Ac），將不同濃度的樣品溶液2 mL與95%乙醇2 mL混勻后測(cè)定吸光度（Aj），按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.2.3 清除·OH的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]方法并略有修改。取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的乙醇溶液，加入0.4 mL的磷酸鹽緩沖液（0.15mol/L，pH 7.40）和0.6 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入待測(cè)酶解液2 mL混勻后，加入0.4 mL 0.1%的H2O2搖勻，37 ℃條件下水浴60 min，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ai）；以去離子水代替酶解液和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ac）；以去離子水代替酶解液來(lái)重復(fù)以上操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度（Aj）。按式（2）計(jì)算·OH清除率。

1.2.2.4 清除O2–·的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]，取酶解液0.1 mL，加入0.1mol/L Tris-HCl（pH8.2）緩沖溶液2.8 mL混勻，在25 ℃水浴10 min后加入3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預(yù)熱）0.1 mL，混勻后迅速在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔30 s讀取A320nm，5 min后結(jié)束；以去離子水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HC1（pH 8.2）緩沖溶液2.8 mL調(diào)零；空白對(duì)照管以去離子水代替酶解液。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按式（3）計(jì)算O2－·清除率。

1.2.3 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件和分組

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)條件為：溫度18～22 ℃、相對(duì)濕度45%～55%，自然光照，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)前將50只小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組（雌雄各半分籠飼養(yǎng)），分別是正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、羅非魚(yú)肉蛋白酶解液低、中、高劑量組。除正常對(duì)照組外，其余4組腹腔注射500 mg/（kg·d）D-半乳糖，同時(shí)羅非魚(yú)肉蛋白酶解液低、中、高劑量組按125、250、500 mg/（kg·d）的劑量灌胃羅非魚(yú)肉蛋白酶解液，正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水，灌胃等體積的蒸餾水，實(shí)驗(yàn)持續(xù)42 d。

1.2.3.2 樣品的制備和抗氧化活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)小鼠末次灌胃后，禁食l2 h，斷頭取血致死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。解剖小鼠，取出肝臟，稱取0.1 g肝臟，加入9倍體積的生理鹽水于勻漿器中制成組織勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。所有處理均在4 ℃條件下完成。

樣品的SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量和T-AOC采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性分析

研究發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)的還原能力與它潛在的抗氧化活性密切相關(guān)?？寡趸镔|(zhì)能夠提供電子把鐵氰化鉀中Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+在700 nm波長(zhǎng)處有最大的吸光度[17]，吸光度值越大說(shuō)明樣品還原能力越強(qiáng)。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度（0.5～2.5 mg/ mL）范圍內(nèi)，還原力（Y）與羅非魚(yú)肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度（x，mg/mL）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y = 0.016 6－0.190 8x（R2=0.993 8）。

圖1 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的還原力Fig.1 Reducing power of tilapia protein hydrolysate

圖2 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

自由基與機(jī)體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1,14]。體內(nèi)過(guò)多的活性氧能與氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子發(fā)生反應(yīng)，造成身體疾病[18]。抗氧化劑能與自由基發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的物質(zhì)。因此，探討羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)DPPH自由基、·OH和O2－·的清除作用具有重要意義。如圖2所示，羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)DPPH自由基的清除率隨著羅非魚(yú)肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，清除率在12.4%～76.2%，兩者呈正相關(guān)；羅非魚(yú)肉蛋白酶解液質(zhì)量濃度在0.5～2 mg/mL時(shí)，兩者線性關(guān)系良好；當(dāng)質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除效果變化不明顯。羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)·OH清除率的變化趨勢(shì)與其清除DPPH自由基相似（圖3），其清除DPPH自由基和·OH的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50）分別為1.57、1.68 mg/mL。如圖4所示，羅非魚(yú)肉蛋白酶解液清除O2–·的能力較弱，EC50僅為2.76 mg/mL。

圖3 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液清除·OH的能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

圖4 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液清除的能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of tilapia protein hydrolysate

2.2 體內(nèi)抗氧化活性分析

D-半乳糖衰老模型被廣泛用于衰老機(jī)理研究和抗氧化劑、延緩衰老藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)[5]。自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生MDA，SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC是體內(nèi)生物防護(hù)體系中最重要的抗氧化指標(biāo)，可清除體內(nèi)的自由基。由表1、圖5、6可知，正常對(duì)照組血清、肝臟組織中SOD活力、T-AOC均顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。高劑量組血清和肝臟組織中SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC不僅顯著高于其相對(duì)應(yīng)的模型對(duì)照組，而且顯著高于其相對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組（P＜0.05）。GSH-Px對(duì)和機(jī)體組織產(chǎn)生的·OH及H2O2有較強(qiáng)的清除能力，可減輕脂質(zhì)由于過(guò)氧化對(duì)機(jī)體組織的造成的損傷，由此推斷，高劑量羅非魚(yú)蛋白酶解液在預(yù)防衰老方面有重要的作用。

表1 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)小鼠血清SOD、GSH-Px活力、T-AOOCC和MDA含量的影響（x±s，n=10）Table 1 Effect of tilapia protein hydrolysate on SOD and GSH-Px activities, MDA level and T-AOC in mouse serum（x ±s,, n = 10）

圖5 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力的影響（x±s，n=10）Fig.5 Effect of tilapia protein hydrolysate on the activities of SOD and GSH-Px in mouse liver (x ±s, n = 10)

圖6 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)小鼠肝臟T-AOC的影響Fig.6 Effect of tilapia protein hydrolysate on T-AOC in mouse liver

體內(nèi)過(guò)量自由基會(huì)侵害細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸，形成過(guò)氧化脂質(zhì)。脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物MDA可與氨基酸和蛋白質(zhì)等反應(yīng)形成脂褐素，使得蛋白質(zhì)破壞變性蓄積于胞漿，最終使細(xì)胞發(fā)生變形壞死[19]。MDA含量的檢測(cè)可以反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。從表1和圖7可以看出，對(duì)照組血清和肝臟組織中的MDA含量顯著低于模型對(duì)照組。3個(gè)劑量組的小鼠血清和肝臟組織中MDA含量均低于模型對(duì)照組，低、中、高劑量血清中MDA含量分別降低了18.9%、34.7%、35.5%，低、中、高劑量組肝臟組織中MDA含量分別較模型對(duì)照組降低了32.6%、35.4%、42.0%。說(shuō)明羅非魚(yú)肉蛋白酶解液具有抗氧化活性，并且呈一定的量效關(guān)系。

圖7 羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響Fig.7 Effect of tilapia protein hydrolysate on MDA level in mouse liver

2.3 肝臟組織及血清中T-AOC/MDA比值

圖8 小鼠肝臟組織及血清中T-AOC/MDA比值Fig.8 T-AOC/MDA ratios in mouse serum and liver

T-AOC/MDA比值能夠較好的反映體內(nèi)抗氧化/氧化平衡狀態(tài)[20]。由圖8可知，肝臟和血清中高劑量組中T-AOC/ MDA比值均顯著高于低劑量組和模型對(duì)照組。其中，血清中高劑量組T-AOC/MDA比值約為模型對(duì)照組的300%，高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），這對(duì)穩(wěn)定、持續(xù)地保持體內(nèi)抗氧化作用將起到積極的促進(jìn)作用。

3 結(jié) 論

羅非魚(yú)肉蛋白酶解液具有較高的還原力和自由基清除能力，可以顯著提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝臟組織中的SOD、GSH-Px活力和T-AOC，降低血清及肝臟組織MDA含量，高劑量羅非魚(yú)肉蛋白酶解液對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化/氧化平衡狀態(tài)有明顯的穩(wěn)定作用。因此羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的整體抗氧化性能較好，有必要研究將其開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑或自由基清除劑。

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Preparation of Tilapia (Oreochromis niloticus) Protein Hydrolysate and Analysis of Its Antioxidant Activity in vitro and in vivo

WANG Qiang, LI Gui-jie, ZHAO Xin, REN Yan-rong
(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Tilapia (Oreochromis niloticus) protein hydrolysate was prepared with papain. Its antioxidant activities at different doses were evaluated in vitro and in vivo using reducing power, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anion radical scavenging assays and D-galactose-induced mouse aging model. The reducing power of the hydrolysate was high. The EC50values in the DPPH radical, hydroxyl and superoxide anion radical scavenging assays were 1.57, 1.68 and 2.76 mg/mL, respectively. The hydrolysate could significantly increase the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidative capacity (T-AOC) in the serum and liver of aging mice (P ＜ 0.05). Furthermore, the content of malondialdehyde (MDA) in serum and liver displayed a reducing trend (P ＜ 0.05). In conclusion, the tilapia protein hydrolysate has a good antioxidant effect in vitro and vivo as expected.

tilapia; hydrolysate; antioxidant activity in vivo; D-galactose-induced mouse aging model

TS254.1

A

1002-6630（2014）05-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201405039

2013-04-13

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ121504）；重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（KJTD201325）

王強(qiáng)（1982—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)橛椭瘜W(xué)及抗氧化生物資源生理生化。E-mail：wangqiang8203@163.com