趙小月，徐懷德*，楊榮香

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

綠茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及主要成分變化分析

趙小月，徐懷德*，楊榮香

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

目的：研究綠茶發(fā)酵酒工藝優(yōu)化及發(fā)酵過程中茶多酚、兒茶素、香氣成分含量的變化分析。方法：采用正交試驗優(yōu)化綠茶酒發(fā)酵工藝，利用高效液相色譜、氣相色譜-質譜法測定兒茶素和香氣成分變化。結果：綠茶酒發(fā)酵工藝參數(shù)為：綠茶用量4 g/L、蔗糖20%、蜂蜜50 g/L、葡萄酒酵母接種量5 g/L，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵10 d后過濾陳釀得綠茶酒；綠茶酒發(fā)酵過程中6種兒茶素組分含量均有所增加，表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸、表兒茶素增加較為緩慢，兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯增加迅速，分別增加了10.88倍和17.33倍；發(fā)酵初始、發(fā)酵結束及陳釀的綠茶酒分別檢測出香氣成分87、88種和94種，各占檢測出揮發(fā)性成分相對含量的92.93%、98.26%和91.87%；香氣成分種類和相對含量在發(fā)酵過程中均變化明顯，體現(xiàn)綠茶酒由茶香到酒香的變化。結論：綠茶可以發(fā)酵茶酒，發(fā)酵后綠茶酒的保健成分兒茶素含量增加，酒體醇香。

綠茶酒；發(fā)酵；兒茶素；香氣成分；變化

茶葉是傳統(tǒng)的天然保健飲品，茶葉中富含茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶多糖等多種營養(yǎng)成分及功能因子，具有防止高血壓、動脈硬化和降低膽固醇的作用[1]。我國是茶葉生產大國，茶的生產和消費主要以茶葉為主，茶葉深加工主要產品有茶飲料、速溶茶、茶多酚等[2]。

以茶葉為原料釀造茶酒，形成一種在口味上具有茶的清香與酒的醇柔，在功效上具有抗氧化、增強機體免疫力、延緩衰老等保健功能茶飲品[3]。茶酒的研發(fā)還有提高低檔茶葉利用率、豐富酒類市場等意義。我國現(xiàn)有茶酒產品已有十余種，釀造方法主要為勾兌法和發(fā)酵法[4-11]。但針對茶酒發(fā)酵過程中茶多酚、兒茶素、香氣成分含量變化的研究還鮮見報道[12]。

本實驗利用陜西紫陽富硒綠茶，采用液態(tài)發(fā)酵法釀造低度綠茶酒，并測定綠茶酒發(fā)酵過程中兒茶素及其組分含量變化和香氣成分變化，為保健型綠茶酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西安康紫陽富硒綠茶，嶺南春茶葉有限公司提供；葡萄酒酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（一級）、蜂蜜 市售。

兒茶素標準品（兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子酸（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）） 上海晶純生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-S6電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興生物科技；WAY-2S阿貝折光儀、雷磁pH-SJ-4A酸度計、FA2004電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 廣東醫(yī)療器械廠；UV mini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；PHS-OS精密pH計上海雷磁儀器廠；酒精計 上海華辰醫(yī)用儀表有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、ISQ氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；HP-INNOWAX彈性石英毛細管柱 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶酒發(fā)酵工藝及操作要點[13]

1.3.1.1 綠茶酒發(fā)酵工藝流程

1.3.1.2 操作要點

用1∶10比例的冷水浸泡茶葉20 min清洗去雜，濾干后加入85 ℃純凈水浸泡20 min后冷卻，加入質量分數(shù)20%蔗糖、50 g/L蜂蜜和0.05 g/L偏重亞硫酸鈉；取茶湯適量以10∶1的比例加入干酵母，35～40 ℃活化35 min，將活化后酵母添加入茶湯中，攪拌后發(fā)酵；當發(fā)酵酒停止產氣和糖度不再降低時主發(fā)酵結束。

1.3.2 綠茶酒發(fā)酵工藝條件確定

1.3.2.1 單因素試驗

在預實驗的基礎上，設定發(fā)酵溫度為28 ℃，分別以發(fā)酵茶葉用量（1、4、7、10 g/L），添加蔗糖180 g/L，接種5 g/L葡萄酒酵母，在28 ℃條件下發(fā)酵10 d后測定原酒各項指標；取4 g茶葉，分別添加不同量的蔗糖（150、180、210、240 g/L），接種5 g/L葡萄酒酵母，在28 ℃條件下發(fā)酵10 d后測定原酒各項指標；取4 g茶葉，添加蔗糖180 g/L，分別接種不同量葡萄酒酵母（2、5、8、11 g/L），在28 ℃條件下發(fā)酵10 d后測定原酒各項指標。

1.3.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇發(fā)酵茶葉用量、蔗糖添加量、酵母接種量三因素三水平設計L9（33）正交試驗，因茶類和酒類產品都屬于嗜好品，所以以感官評分作為最終產品評價的主要指標確定最佳發(fā)酵工藝[14-15]。

1.3.3 綠茶酒理化指標測定方法[5,14]

可溶性固形物含量（soluble solid content，SSC）：可溶性固形物是樣品中所有溶解于水的化合物的總稱，主要指可溶性糖?？扇苄怨绦挝锖靠杀硎緲悠分械奶呛俊２捎檬殖质秸酃鈨x測量。酒精度：酒精計法；總酸：酸堿中和滴定法，以酒石酸計；pH值：pH計法；澄清度：紫外-可見分光光度計，蒸餾水作空白，在波長540 nm處用1 cm比色杯測定透光率；色度：紫外-可見分光光度計，蒸餾水作空白，在波長420 nm處用l cm比色杯測定吸光度（A420nm）；茶多酚：參照GB/T21733—2008《茶飲料》[15]方法；原酒感官評分標準：參考《葡萄酒工業(yè)手冊》[16]，按表1中標準進行。

表1 綠茶酒感官評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of green tea wine

1.3.4 綠茶酒發(fā)酵過程中茶多酚和兒茶素組分含量的測定

1.3.4.1 色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀：SPD-20A紫外檢測器；Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相A：0.2%乙酸水溶液；流動相B：乙腈，洗脫程序如表2所示；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 ?L；紫外檢測波長：278 nm[17]。

表2 兒茶素組分測定梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for catechins

1.3.4.2 標準曲線的繪制

標準儲備液的配制：準確稱取C、EC、GCG、EGC、ECG、EGCG標準品各10.0 mg，用甲醇溶解，定容10 mL，得到1 mg/mL各標準品儲備液，密封于－4 ℃冰箱中保存。

制定標準曲線：準確將初始質量濃度為0.1 mg/mL的兒茶素混標（含EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG）按1、1/3、1/6、1/9、1/12、1/15比例準確稀釋后，上機檢測，以峰面積與組分質量濃度為因素，分別制定標準曲線（圖1、表3）。

圖1 兒茶素混標的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of different catechins standards

表3 兒茶素組分標準曲線Table 3 Standard curve of catechins

1.3.4.3 樣品測定

根據(jù)最佳發(fā)酵工藝參數(shù)進行發(fā)酵，每天定時取樣，沸水浴20 min滅活酵母，取上清液經過濾后測定6種兒茶素含量。

1.3.5 綠茶酒香氣成分分析[18]

1.3.5.1 香氣富集

采用頂空固相微萃取法。在15 mL裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入3.0 g NaC1，8 mL綠茶酒樣品，50 ℃平衡10 min，PDMS纖維頭經氣相色譜進樣口于250 ℃老化30 min，穿過封墊置于頂空瓶的上部頂空處，在50 ℃吸附40 min。

1.3.5.2 香氣檢測

將富集香氣成分的固相微萃取纖維頭插入氣相色譜進樣口，解析3 min。色譜條件：分流方式為不分流，色譜柱為DB-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序為：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，再以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min。載氣為He，體積流量為1 mL/min，進樣口溫度為250 ℃。質譜條件：EI＋電離源，電子能量70 eV，燈絲流量0.20 mA。檢測器電壓350 V。掃描范圍為33～450 u，離子源溫度為200 ℃。

1.3.5.3 圖譜分析

由氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS）分析得到的質譜數(shù)據(jù)，由計算機在NIST標準譜庫的檢索，同時參照已發(fā)表的質譜資料鑒定大部分峰[19]。由峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。僅采用匹配度和純度大于800的鑒定結果。

1.3.5.4 樣品測定

分別取發(fā)酵初始階段酒樣、發(fā)酵結束后綠茶酒及經60 d陳釀的綠茶酒樣品進行香氣成分測定。

2 結果與分析

2.1 綠茶酒發(fā)酵工藝的單因素試驗結果

2.1.1 茶葉用量對綠茶酒品質的影響

表4 不同茶葉用量發(fā)酵后原酒各項指標檢測結果Table 4 Effect of tea to water ratio on properties of green tea wine

茶葉用量是決定最終茶酒風味的重要因素，不同量茶葉對發(fā)酵原酒的影響結果如表4所示。茶葉用量為1 g時，茶酒顏色較淺且混濁，茶香淡薄，發(fā)酵茶酒酒體風味不突出；茶葉用量為10 g時，茶湯苦澀味重，綠茶清香被掩蓋，茶葉用量4 g時綠茶酒酒精度最高，品質最佳，所以選取4 g左右的茶葉用量進行正交試驗。

2.1.2 蔗糖添加量對綠茶酒品質的影響

表5 不同蔗糖添加量發(fā)酵后原酒各項指標檢測結果Table 5 Effect of sugar addition on properties of green tea wineTable 5 Effect of sugar addition on properties of green tea wine

酵母通過無氧呼吸將糖分轉化為酒精，因此發(fā)酵液中的蔗糖添加量對發(fā)酵結果有直接影響。蔗糖添加量對發(fā)酵原酒的影響結果如表5所示。蔗糖添加量為190 g/L時所得茶酒風味最好。蔗糖添加量較低時酵母發(fā)酵不完全，產生酒精較少；蔗糖添加量過高時，綠茶酒酒精度高，但發(fā)酵時間長，殘?zhí)橇扛?，且在高滲透壓下酵母菌的代謝活動會受到抑制，所以選擇蔗糖添加量在190 g/L左右進行進一步實驗。

2.1.3 酵母接種量對綠茶酒品質的影響

表6 不同酵母用量發(fā)酵后原酒各項指標檢測結果Table 6 Effect of yeast inoculum size on properties of green tea wine

酵母接種量對綠茶酒品質的影響結果如表6所示。當接種量為2 g/L時，發(fā)酵緩慢，殘?zhí)橇扛撸l(fā)酵不徹底；接種量為11 g/L時，發(fā)酵迅速，酒精度高，但原酒風味差。在發(fā)酵過程中，隨著酵母接種量的增加，糖被降解速率加快，生成的酒精速度加快。但接種量過大時，營養(yǎng)物質消耗迅速，代謝反應劇烈，酒體品質下降，所以選取酵母接種量為5 g/L左右進行后續(xù)實驗。

2.2 綠茶酒發(fā)酵工藝的正交試驗

表7 綠茶酒發(fā)酵工藝正交試驗方案及結果Table 7 Orthogonal array design and results for optimization of theTable 7 Orthogonal array design and results for optimization of the fermentation process of green tea wine

綠茶酒發(fā)酵工藝的正交試驗結果如表7所示，不同因素對綠茶酒發(fā)酵的影響程度依次為酵母接種量＞綠茶用量＞蔗糖添加量。綠茶酒發(fā)酵的最佳條件為：酵母接種量為5 g/L，蔗糖添加量為200 g/L，綠茶用量為4 g/L。

對優(yōu)選的綠茶酒發(fā)酵工藝進行實驗驗證，茶用量為4 g/L、蔗糖200 g/L、蜂蜜50 g/L、葡萄酒酵母接種量5 g/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵10 d，過濾得綠茶酒pH值為3.54，可溶性固形物含量為5%，酒精度12%，色度0.511，感官評分93分，酒體呈清透黃綠色，酒香濃郁，茶香怡人，酸甜適中，具有本品獨特的風格。

2.3 綠茶酒質量標準[20-23]

2.3.1 感官質量標準

外觀：清澈透明，呈黃綠色，無明顯懸浮物和沉淀物；香氣：具有綠茶和酒的復合香氣；口感：酒體豐滿，醇厚協(xié)調，酸甜爽口；風格：具有本品特殊風格。

2.3.2 理化質量標準

酒精度：（12±0.2）%；可溶性固形物含量≤6%；總酸：（4.0±0.2） g/L。

2.3.3 衛(wèi)生質量標準

符合GB2757—1981《蒸餾酒及配制酒衛(wèi)生標準》。

2.4 綠茶酒發(fā)酵過程中茶多酚及兒茶素組分含量變化分析

2.4.1 綠茶酒發(fā)酵過程中茶多酚含量變化分析

圖2 綠茶酒發(fā)酵過程中茶多酚含量的變化Fig.2 Changes in the contents of tea polyphenols during fermentation

如圖2所示，發(fā)酵過程中茶多酚的含量逐漸增加，發(fā)酵起始變化較小，發(fā)酵1～5 d迅速增加，第5天比第1天增加123%，隨后發(fā)酵過程中茶多酚含量穩(wěn)定[24]。

2.4.2 綠茶酒發(fā)酵過程中兒茶素各組分含量變化分析

圖3 綠茶酒發(fā)酵過程中兒荼素各組分含量的變化Fig.3 Changes in the contents of catechins during fermentation

如圖3所示，6種兒茶素組分的含量都有所升高。其中兩種酯型兒茶素EGC、GCG含量變化較小，分別由起始的52.76 ?g/mL和3.68 ?g/mL上升為發(fā)酵結束的92.33 ?g/mL和3.90 ?g/mL；表沒食子兒茶素ECG和表兒茶素EC，分別由起始的4.33 ?g/mL和7.86 ?g/mL上升為發(fā)酵結束的19.19 ?g/mL和22.24 ?g/mL。單兒茶素中兒茶素C和酯型兒茶素中的EGCG變化較大，C由起始的12.01 ?g/mL增加到142.72 ?g/mL，增加了10.88倍，EGCG由8.26 ?g/mL上升到151.38 ?g/mL，增加了17.33倍。C和EGCG在抗菌、消炎、抗氧化、降壓降糖、防治神經損傷等方面都有顯著作用[25-26]，其含量增加對綠茶酒的保健作用有重要貢獻。

2.5 綠茶酒發(fā)酵及陳釀過程中香氣成分變化分析

表8 綠茶酒發(fā)酵過程中主要香氣成分與相對含量變化比較Table 8 Comparisons of major aroma components and relative contents during the fermentation process of green tea wine

續(xù)表8

續(xù)表8

發(fā)酵初始、發(fā)酵結束及陳釀的綠茶酒檢出各類成分的相對含量見表8和圖4，結果顯示發(fā)酵初始、發(fā)酵結束及陳釀的綠茶酒分別檢測出香氣成分87、88種和94種，各占檢測出揮發(fā)性成分相對含量的92.93%、98.26%和91.87%。其中發(fā)酵前茶湯中檢測出醇類物質20種，酯類物質34種，酸類、醛類、酮類、酚類物質各9、4、5、1種，烴及其衍生物14種；發(fā)酵結束后綠茶酒中檢測出醇類物質20種，酯類物質32種，酸類、醛類、酮類、酚類物質各10、8、2、2種，烴及其衍生物14種；陳釀后的綠茶酒中檢測出醇類物質27種，酯類物質23種，酸類、醛類、酮類、酚類物質各9、3、8、4種，烴及其衍生物20種。

圖4 綠茶酒發(fā)酵過程中主要香氣成分與相對含量變化Fig.4 Comparisons of different groups of aroma components and their relative contents during the fermentation process of green tea wine

發(fā)酵初始階段樣品中，含量較高的物質有異戊醇（27.40%）、苯乙醇（7.39%）、癸酸乙酯（7.30%）、異丁醇（2.63%），其中苯乙醇和癸酸乙酯是綠茶的特征香氣成分[27]，其嗅覺閾值較低，香氣值很高，而且在發(fā)酵過程中含量不斷減少，此階段的含量最高，使此時發(fā)酵液仍顯示茶香特征。發(fā)酵結束后樣品香氣成分中，含量較高的物質有乙醇（37.11%）、異戊醇（30.63%）、異丁醇（5.39%）、苯乙醇（3.51%）、辛酸（3.47%）、乙酸乙酯（2.93%），此階段醇的含量大幅度提高，占到總香氣成分的77.88%，其他種類成分較初始階段均有所減少，此時的酒樣主要因大量醇類積累而顯示濃重酒香。

陳釀后的綠茶酒檢測結果顯示，醇類物質含量下降為30.84%，酯類物質的含量升高到50.45%。醇類物質含量減少，但種類數(shù)由發(fā)酵結束時的20種增加到27種，橙花叔醇（0.24%）有像玫瑰、鈴蘭和蘋果花的氣息，正己醇（0.09%）有水果香氣和青草味，多種醇類物質協(xié)同作用為陳釀綠茶酒提供醇厚酒香。酯類物質中月桂酸乙酯（0.55%）具有優(yōu)雅的香脂香和蜜香花香等香氣，辛酸乙酯（0.44%）有令人愉快的花果香氣和白蘭地酒香，正己酸乙酯（0.21%）有強烈的果香和酒香香氣，乙酸異戊酯（0.15%）較強的新鮮果香，棕櫚酸乙酯（0.15%）有蘋果和菠蘿似香味，這些酯類含量較低但香味獨特，在其他類型茶酒和果酒中也有檢出[19,27]，說明這些酯類是提供酒體香氣的重要成分。

在發(fā)酵和陳釀過程中，酸類成分含量逐漸減少，發(fā)酵初始時占總香氣成分的11.99%，發(fā)酵結束時占總香氣成分的7.44%，陳釀結束后僅占總香氣成分的2.46%，可見隨著發(fā)酵和陳釀的進行，綠茶酒的揮發(fā)性酸不斷降低。醛類物質隨著發(fā)酵進行不斷減少，酮類、酚類和烴及其衍生物在陳釀過程中有所增加。壬醛（0.10%）、癸醛（0.12%）、香葉基丙酮（0.43%）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（0.26%）、2,6-二叔丁基對甲酚（0.40%）、2,4-二叔丁基苯酚（0.13%）、正十六烷（0.94%）、正十四烷（0.24%）、正十五烷（0.33%）、茶香螺烷（0.09%）、十七烷（1.14%）、萘（0.10%）等物質，均為構成綠茶香氣的主要成分[28]，在陳釀后的綠茶酒酒樣中檢出，說明這些物質對綠茶酒獨特的清新茶香有貢獻。

3 結 論

綠茶酒發(fā)酵工藝參數(shù)為：綠茶用量為4 g/L、蔗糖添加量為200 g/L、蜂蜜用量為50 g/L、葡萄酒酵母接種量為5 g/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵后的綠茶酒酒精度為12%，色澤清透，口感醇柔，具有本品的獨特風格，符合綠茶酒質量標準。

綠茶酒發(fā)酵過程中6種兒茶素組分的含量均有所升高，EGC、EC、GCG、ECG發(fā)酵前期平穩(wěn)增加，后期趨于穩(wěn)定，C和EGCG變化較大，分別增加了10.88倍和17.33倍；綠茶酒中茶多酚含量逐漸增加，后期趨于穩(wěn)定。

發(fā)酵初始、發(fā)酵結束及陳釀的綠茶酒分別檢測出香氣成分87、88種和94種，各占檢測出揮發(fā)性成分相對含量的92.93%、98.26%和91.87%。醇類物質在各階段樣品檢出的香氣成分中含量均較高，酯類物質含量在發(fā)酵結束后相對含量較低，陳釀過程中又升高，酸類物質隨發(fā)酵和陳釀的進行而減少，醛類、酮類和酚類物質相對含量較低，但含量和種類也有較大變化，烴及其衍生物的含量和種類在陳釀階段大幅增加。多種香氣成分協(xié)同作用，使發(fā)酵綠茶酒具有獨特風味。

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Optimization of Fermentation Conditions of Green Tea Wine and Changes in Its Main Components during Fermentation

ZHAO Xiao-yue, XU Huai-de*, YANG Rong-xiang
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Purpose: To optimize the fermentation process of green tea wine and investigate the changes in polyphenols, catechins and aroma components during fermentation. Methods: Orthogonal array experiments were used to optimize the fermentation process. The changes in catechins and aroma components were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results: The optimal fermentation parameters were determined as follows: 4 g/L green tea infusion with 20% glucose and 50 g/L honey added, 5 g/L wine yeast inoculum size, and fermentation at 28 ℃ for 10 days. The contents of six catechins were increased during fermentation. Specifically, the conten ts of (－)-epigallocatechin (EGC), (－)-gallocatechin gallate (GCG), epicatechin gallate (ECG), and epicatechin (EC) were slightly increased; however, the contents of catechin (C) and epigallocatechin-3-gallate catechin (EGCGC) were increased by 10.88 and 17.33-folds, respectively. These results indicate that the increase of catechins plays an important role in the health-promoting function of green tea wine. There were 87, 88 and 94 aroma components in the wine at the initial and the last stages of fermentation and the aged wine, which accounted for 92.93%, 98.26% and 91.87% of the total volatile components, respectively. The signifi cant differences in the types and amounts of aroma components indicate the transition from the tea fl avor to the wine aroma components. Conclusions: Green tea can be fermented into wine; the health-promoting components (catechins) of green tea are increased to different extents and the green tea wine is mellow.

green tea wine; fermentation; catechin; fl avoring compositions; variation

TS261.4；O657.63

A

1002-6630（2014）05-0169-07

10.7506/spkx1002-6630-201405034

2013-04-09

趙小月（1988—），女，碩士研究生，主要從事食品貯藏與加工研究。E-mail：xiaoyuez11@126.com

*通信作者：徐懷德（1964—），男，教授，學士，主要從事食品貯藏加工及天然產物提取研究。E-mail：xuhuaide@sohu.com