荊宏偉 孔垂?jié)?張哲 郭坤峰

ZNT1在膀胱癌組織中的表達(dá)及臨床意義

荊宏偉 孔垂?jié)?張哲 郭坤峰

目的明確ZNT1在膀胱癌組織中表達(dá)情況，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。方法免疫組化檢測(cè)23例膀胱癌和9例正常膀胱組織中ZNT1的表達(dá)情況;利用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測(cè)膀胱組織中ZNT1的mRNA和蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)ZNT1在膀胱癌組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析ZNT1基因表達(dá)的臨床意義。結(jié)果免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示ZNT1在正常膀胱組織中表達(dá)非常微弱，其陽(yáng)性率為22.2%，而在膀胱癌組織中其陽(yáng)性率為87%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Real Time RT-PCR及Western Blot結(jié)果均顯示ZNT1在膀胱癌組織中表達(dá)顯著升高，與其在正常膀胱組織中的表達(dá)量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論ZNT1在mRNA及蛋白水平，在膀胱癌中的表達(dá)含量與其在正常膀胱組織的表達(dá)量相比均顯著升高，有可能成為膀胱癌的一個(gè)早期診斷指標(biāo)。

膀胱腫瘤;ZNT1;鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體

膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤。在美國(guó)男性中，膀胱癌是第四位最常見(jiàn)的癌癥，是癌癥致死的第九大原因，男女患者的比例大約是 3∶1.1［1］。膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，涉及到很多方面，對(duì)此人們也已展開(kāi)廣泛的研究，關(guān)于微量元素及其相關(guān)蛋白在癌癥中的作用以及與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸引起了人們的重視。目前研究表明在膀胱癌患者中，血鋅含量低于健康人群［2］，而尿鋅的含量明顯高于健康人群，說(shuō)明在膀胱癌中鋅的代謝存在異常，在侵襲性膀胱癌中，尿鋅含量要高于淺表性膀胱癌和健康人群，同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)在膀胱癌發(fā)生的早期，組織的鋅已經(jīng)開(kāi)始下降，因而推測(cè)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中有可能起到很重要的作用。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc Transporter，ZnT)家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，其主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞內(nèi)，與其功能相反的是鋅鐵調(diào)控蛋白(ZRT，IRT-like protein，ZIP)家族，其主要是將鋅離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞，兩者共同作用維持細(xì)胞內(nèi)鋅離子的穩(wěn)定。ZNT1屬于ZNT家族的一員，在鋅離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要的作用，本試驗(yàn)利用免疫組化檢測(cè)ZNT1在23例膀胱癌及9例膀胱正常黏膜中的表達(dá)情況，同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)62例膀胱癌及15例正常膀胱黏膜組織中ZNT1的RNA和蛋白表達(dá)情況，揭示其與膀胱癌臨床分期及病理分級(jí)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明ZNT1在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 膀胱組織蠟塊均來(lái)自2010年12月至2012年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科住院病例。其中膀胱癌患者23例，年齡32～75歲，平均年齡48.7歲。病理分類(lèi)均為膀胱移行細(xì)胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行細(xì)胞癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí):G1級(jí)11例、G2級(jí)9例、G3級(jí)3例。膀胱癌2009 TNM分期系統(tǒng)(UICC):Ta 15例、T1 4例、T2 1例、T3 2例、T4 1例。62例膀胱癌及15例癌旁正常膀胱新鮮組織標(biāo)本均為2011年3月至2012年11月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科住院并接受手術(shù)治療的原發(fā)性膀胱尿路上皮癌患者的新鮮膀胱癌組織和癌旁正常組織，所有標(biāo)本均得到患者授權(quán)，所有患者均為初發(fā)，復(fù)發(fā)性膀胱腫瘤和手術(shù)前曾接受放療或化療的患者標(biāo)本剔除本研究。癌旁組織距離腫瘤邊緣大于2 cm。所有患者在行膀胱部分切除或全切后留取標(biāo)本于Trazol中－80℃保存，當(dāng)日或次日提取總RNA和總蛋白。62膀胱癌患者年齡29～70歲，平均年齡43.4歲，入院均行經(jīng)血尿生化、泌尿系直腸超聲、膀胱CT或CTU檢查。病理分類(lèi)均為膀胱移行細(xì)胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行細(xì)胞癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí):G1級(jí)45例、G2級(jí)11例、G3級(jí)6例。膀胱癌2009 TNM分期系統(tǒng)(UICC):Ta 26例、T1 17例、T2 11例、T3 5例、T4 3例。腫瘤組織標(biāo)本獲得方式:經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)42例，膀胱部分切除術(shù)9例，膀胱全切術(shù)11例。

1.2 主要試劑及溶液配制 兔抗人ZNT1克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;鼠抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色劑、枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液0.01 mol/L，pH值6.0、PBS緩沖液:0.01 mol/L，pH 值7.2 ～7.4 均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;SYBR?PrimeScriptTM RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自大連Takara公司;上下游引物均由大連寶生物工程有限公司(Takara)設(shè)計(jì)合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化(SP法):免疫組化結(jié)果判定免疫組化結(jié)果判定方法:ZNT1定位于細(xì)胞膜，胞膜出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用陽(yáng)性染色強(qiáng)度結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行判斷。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn):無(wú)色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。高倍鏡下每張切片隨機(jī)觀察4個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，1% ～10%為1分;11% ～50%為2分，51% ～75%為3分;﹥75%為4分。兩項(xiàng)得分相乘，滿(mǎn)3分為“+”;4分為“++”;5分以上為“+++”，“+ ～ +++”為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 Real-Time RT PCR:①引物:ZNT1上游引物:5’-TACCAFCAACTCCAACGG-3’;ZNT1 下游引物:5’-GAACCCAAGGCATCTCCA-3’;β-actin 上游引物:5’-TGGCACCC AGCAC A A TGAA-3’;β-actin 下游引物:5’-CTAAGTCATAGTCCGCC TAGAA GCA-3’;②組織RNA提取;③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);④實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)本實(shí)驗(yàn)采用SYBRGreen嵌合熒光進(jìn)行反應(yīng)，按說(shuō)明書(shū)配置25 μl反應(yīng)體系。

1.3.3 Western Blot:①組織蛋白提取;②蛋白濃度測(cè)定(BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒);③SDS-PAGE電泳;④轉(zhuǎn)膜;⑤ZNT1蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)應(yīng)用Chemi Image 5500凝膠成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用Image J分析條帶灰度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示ZNT1定位于膀胱癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，其在膀胱癌組織中表達(dá)明顯，其陽(yáng)性表達(dá)率為87.0%(20/23)，而在癌旁正常膀胱組織中表達(dá)非常微弱，其陽(yáng)性率為22.2%(2/9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.784，P ＜0.01)。見(jiàn)圖 1。

圖1 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá)

2.2 Western Blot ZNT1在膀胱癌組織中的蛋白表達(dá)含量與其在正常膀胱黏膜組織中的表達(dá)含量相比亦明顯升高，與免疫組化結(jié)果及ZNT1 mRNA的變化趨勢(shì)相一致，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 ZNT1蛋白在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá)

2.3 Real Time RT-PCR ZNT1在62例膀胱癌組織中ZNT1的mRNA表達(dá)含量與其在15例正常膀胱黏膜組織中的表達(dá)含量相比，ZNT1的表達(dá)含量顯著升高，ZNT1 mRNA在膀胱癌組織中的平均表達(dá)含量為正常膀胱黏膜組織中的6.6倍，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、4。

圖3 ZNT1 mRNA在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá)

圖4 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴(kuò)增曲線和溶解曲線(A＆B:ZNT1在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴(kuò)展曲線和溶解曲線;C＆D:β-actin在膀胱癌及正常膀胱組織中的擴(kuò)增曲線和溶解曲線)

3 討論

鋅是機(jī)體組織和細(xì)胞內(nèi)必需的微量元素，其參與體內(nèi)多種蛋白質(zhì)、核酸的合成和分解代謝酶的活性和構(gòu)成，鋅缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育遲緩，DNA合成修復(fù)受損，免疫功能缺陷等一系列疾?。?］。在膀胱癌患者中，血鋅含量低于健康人群［4］，而尿鋅的含量明顯高淺表性膀胱癌細(xì)胞的凋亡影響更明顯，推測(cè)鋅與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能有很大的關(guān)系，因而對(duì)鋅及與其相關(guān)的蛋白都成為研究的熱點(diǎn)［5］。

新近發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc Transporter，ZnT)家族是一類(lèi)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，其主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞，與其功能相反的是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc Transporter，ZnT)家族，其主要是將鋅離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，兩者共同作用維持細(xì)胞內(nèi)鋅離子的穩(wěn)定。目前研究顯示鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體與許多惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，其在乳腺癌和胰腺癌進(jìn)展中作用已經(jīng)得到部分證實(shí)［6，7］。ZnT1是ZnT家族中最先被發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，在組織器官分布方面，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1也表現(xiàn)出特殊規(guī)律，其主要分布在小腸上皮細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞及胰腺腺細(xì)胞等，有研究表明 Cd2+、Cu2+、Mg2+、Na+、K+、Cl－等，對(duì) ZnT1 的鋅外排作用幾乎無(wú)影響［8］，說(shuō)明ZnT1對(duì)鋅的外排不受這些離子的干擾，是專(zhuān)一性的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體。

本研究首次應(yīng)用免疫組化，Real Time RT-PCR及Western Blot在蛋白及mRNA水平上檢測(cè)ZNT1在膀胱癌及癌旁正常膀胱表達(dá)差異。免疫組化染色顯示ZNT1在膀胱癌組織中具有很高的陽(yáng)性表達(dá)率(87.0%)，而在癌旁正常膀胱組織中表達(dá)含量很低，其陽(yáng)性率僅為22.2%，其組織間表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Western Blot檢測(cè)亦顯示ZNT1在膀胱癌組織中具有更高的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示ZNT1 mRNA在膀胱癌中的表達(dá)含量與其在癌旁正常膀胱組織中的表達(dá)量相比升高顯著，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，ZNT1 mRNA在膀胱癌組織中的平均表達(dá)含量為癌旁正常膀胱組織中的6.6倍。我們的研究結(jié)果顯示在mRNA和蛋白水平上，ZNT1在膀胱癌組織中的表達(dá)均明顯升高，表明其有可能成為膀胱癌早期診斷的一個(gè)良好指標(biāo)。

總之，通過(guò)本研究我們認(rèn)為ZNT1在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯升高，ZNT1可作為膀胱癌的一個(gè)早期診斷指標(biāo)，其在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮有很重要的作用，這也為我們后續(xù)研究奠定了良好的基礎(chǔ)，隨著研究的不斷深入它有可能成為膀胱癌治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significance of zinc transporter ZNT1 in bladder carcinoma

JING Hongwei，KONG Chuize，ZHANG Zhe，et al.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

ObjectiveTo detect the expression levels of zinc transporter(ZNT1)in normal bladder mucosal tissue and bladder carcinoma tissues in order to provide scientific data for further study.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression levels of ZNT1 in 23 cases of bladder cancer tissue and 9 cases of normal bladder tissue.Real Time RT-PCR and Western Blot were used to detect the mRNA and protein levels of ZNT1 in bladder carcinoma and normal bladder mucosal tissue so as to analyze the clinical significance of ZNT1 gene expression.ResultsThe immunohistochemical results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were relatively lower，with the expression positive rate being 22.2%，however，which in bladder cancer tissue was 87%，there were significant differences between normal bladder tissue and bladder cancer tissue(P ＜ 0.01).Both the Real Time RT-PCR and Western Blot analysis results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were significantly increased，as compared with those in normal bladder tissues(P ＜0.01).ConclusionThe expression levels of ZNT1 mRNA and protein in bladder cancer tissue are obviously increased，as compared with those in normal bladder tissue，which may be one of indexes in the early diagnosis of bladder cancer.

bladder cancer;ZNT1;zinc transporter

R 737.14

A

1002－7386(2014)09－1285－04

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.09.001

項(xiàng)目來(lái)源:高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)(博導(dǎo)類(lèi))(編號(hào):20112104110006)

110001 沈陽(yáng)市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科

孔垂?jié)桑?10001 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科;

E-mail:jhw_david@sina.com

2013－10－13)