游 泳杜瑩瑩曹 媛 李真珍張勝軍

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州 450052;2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南鄭州 450052

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是指宮頸不典型增生和宮頸原位癌，其為宮頸浸潤癌的癌前期病變。CIN進(jìn)展演變?yōu)閷m頸癌是一個連續(xù)的過程，明確CIN進(jìn)展的分子機(jī)制對宮頸癌的預(yù)防和治療具有重要的意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一種可降解ECM的蛋白水解酶，與乳腺癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物 (tissu inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，與MMPs結(jié)合抑制其活性[1]。目前，已有文獻(xiàn)報道MMPs和TIMPs與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]，但其在CIN各級中的表達(dá)情況尚不完全清楚。本研究分析了MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1、TIMP-2在CIN中的表達(dá)情況及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年2月—2013年12月我院診治的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者 78例。年齡 26～41 歲，平均(34±2.9)歲。其中，CINⅠ級患者19例(CINⅠ組)、CINⅡ級患者28例(CINⅡ組)和CINⅢ級患者31例(CINⅢ組)。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫、冷凍和激光等治療，經(jīng)病理學(xué)確診。同時，取同期行手術(shù)治療的正常宮頸組織標(biāo)本30例為對照組，年齡28～45歲，平均(36.5±3.8)歲。各組患者在年齡方面無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)CIN各組患者取病變組織標(biāo)本2份，對照組任取宮頸組織2份；生理鹽水沖洗后，1份行常規(guī)病理檢查確診，1份置于-70℃冰箱中待檢。采用Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，應(yīng)用RT-PCR試劑盒(購自上海生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-action為內(nèi)參照，與目的基因同一程序同時擴(kuò)增。94℃變性45 min，60℃退火1 min，72℃延伸1.5min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，后溴化乙錠(0.5 mg/mL)染色。紫外線觀測儀檢查有無特異條帶并攝影，有目的基因條帶及內(nèi)參條帶者為陽性表達(dá)，只有內(nèi)參條帶者為陰性表達(dá)，用圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)進(jìn)行圖像掃描分析。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物含量以MarkerⅠ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，目的基因mRNA表達(dá)水平=目的基因的灰度值/β-action的灰度值×100%。目的基因和β-action基因序列見表1。

表1 目的基因和β-action基因序列

1.2.2 參數(shù)比較 記錄各個因子 (MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2)mRNA的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平。比較各組患者相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值以(mean±SD)表示。數(shù)值變量采用兩隨機(jī)樣本t檢驗和方差分析，分類變量采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組患者M(jìn)MP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)情況比較

CINⅢ組患者M(jìn)MP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著高于CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者M(jìn)MP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著高于CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅠ組和對照組患者在MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。

2.2 各組患者TIMP-2和TIMP-1 mRNA的表達(dá)情況比較

CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著低于CINⅡ組、CINⅠ組和對照組 (P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達(dá)水平顯著低于CINⅠ組(P<0.05)，而兩組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達(dá)率方面無顯著性差異(P>0.05)。CINⅠ組和對照組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。

表2 各組相關(guān)因子的陽性表達(dá)率[n(%)]

表3 各組相關(guān)因子的表達(dá)水平（±s）

表3 各組相關(guān)因子的表達(dá)水平（±s）

注：表示與 CINⅡ組相比，＆P<0.05；表示與 CINⅢ組相比，§P<0.05。

組別 例數(shù)MMP-2MMP-9TIMP-2 TIMP-1 CINⅠ組CINⅡ組CINⅢ組對照組19 28 31 30 39.64±9.96＆§73.56±14.87§95.47±19.54＆35.63±9.72＆§33.57±9.63＆§69.84±14.42§90.28±19.25＆32.71±9.42＆§98.65±20.54＆§75.67±15.84§62.82±13.21＆105.36±24.23＆§93.86±19.86＆§81.29±16.02§68.53±13.86＆109.53±24.62＆§

3 討論

CIN是宮頸浸潤癌的癌前期病變，患者多無特異性的臨床表現(xiàn)，確診主要依靠組織學(xué)檢查。根據(jù)宮頸上皮細(xì)胞不典型增生的程度，CIN分為I、II、III級，每個級別的患者都有可能發(fā)生癌變，通常來講，級別高的患者發(fā)生癌變的可能性較高，級別低的患者發(fā)生自然退縮的機(jī)率較高。MMPs/TIMPs是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要因子，其與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。因此，分析MMPs和TIMPs在各級CIN患者中的表達(dá)情況有助于揭示CIN進(jìn)展和宮頸浸潤癌發(fā)生的機(jī)制。

MMPs是一種降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，可以破壞基底膜屏障及局部的組織結(jié)構(gòu)。正常情況下MMPs的活性和表達(dá)水平較低，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病理狀態(tài)時或者受到某種刺激的情況下其表達(dá)水平會升高。有報道稱，CIN組織具有和正常宮頸組織相似的完整基底膜，但其組織或結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的異常；而宮頸癌組織的基底膜受損嚴(yán)重，大部分基底膜丟失[3]。另有報道稱，在宮頸癌形成的早期即可發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)的異常，CIN患者M(jìn)MP-2的陽性表達(dá)率顯著高于正常人[4]。

范懿雋等[5]研究顯示，MMP-2在CIN組織中呈高表達(dá)，明顯高于正常對照組，隨著CIN級別增加其表達(dá)水平增高。本研究發(fā)現(xiàn)，CINⅢ組患者M(jìn)MP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著高于 CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者 MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著高于CINⅠ組和對照組。與上述研究結(jié)果不盡一致，提示隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平增加，此可能與CIN的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，二者表達(dá)水平可作為判斷CIN病情、評估預(yù)后的參考指標(biāo)。

TIMPs是體內(nèi)MMP的天然抑制物，主要是由結(jié)締組織和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛分布于各種組織和體液中，其主要功能是與MMPs結(jié)合，使MMPs喪失活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。有報道稱，宮頸原位癌(CINⅢ)患者TIMP-1和TIMP-2的陽性表達(dá)率顯著高于正常對照組[6]。尹香花等[7]報道稱，宮頸癌患者TIMP-2表達(dá)陽性率顯著高于CIN患者和宮頸炎患者，而CIN患者TIMP-2表達(dá)陽性率與宮頸炎患者無顯著性差異。張?zhí)旆宓萚8]研究顯示，CINⅢ患者TIMP-2的表達(dá)高于CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者，而CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者之間TIMP-2的表達(dá)無顯著性差異。本研究發(fā)現(xiàn)，CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平分別顯著低于CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達(dá)水平顯著低于對照組和CINⅠ組。與上述研究結(jié)果不盡一致，這可能與研究樣本量有關(guān)；此結(jié)果提示TIMP-2和TIMP-1表達(dá)水平下調(diào)，可能與CIN的生物學(xué)行為相關(guān)，在CIN的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用。

綜述所述，隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平上調(diào)、TIMP-2和TIMP-1表達(dá)下調(diào)。MMPs/TIMPs表達(dá)變化可能與CIN的生物學(xué)行為相關(guān)，在CIN的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用，可作為判斷CIN病情、評估預(yù)后的參考指標(biāo)。

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