吳雨龍，華 春*，扶慶權(quán)，吳向華

（南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171）

蘆蒿總黃酮提取物的急性毒性及遺傳毒性

吳雨龍，華 春*，扶慶權(quán)，吳向華

（南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171）

目的：研究蘆蒿總黃酮提取物的安全性。方法：采用急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓染色體畸變實(shí)驗(yàn)和Ames試驗(yàn)，觀察蘆蒿總黃酮提取物的急性毒性和遺傳毒性作用。結(jié)果：蘆蒿總黃酮提取物急性毒性的LD50＞10 g/kg，遺傳毒性實(shí)驗(yàn)為陰性。結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，未觀察到蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠有急性毒性及遺傳毒性作用。

蘆蒿；總黃酮；急性毒性；遺傳毒性

蘆蒿（Artemisia selengensis Turcz.）又名藜蒿、蔞蒿等,富含黃酮等多種生物活性物質(zhì)[1-2]。而總黃酮物質(zhì)在抗 炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等方面都表現(xiàn)出了較好的活 性。Silvina等[3]研究表明經(jīng)常食用富含黃酮的食物能極大提高機(jī)體的抗氧化能力，能有效清除羥自由基和超氧陰離子，抑制丙二醛的氧化作用，降低慢性病的發(fā)生率。Zheng Weifa等[4]發(fā)現(xiàn)從芫花根提取的總黃酮能夠保護(hù)外周血淋巴細(xì)胞的腫瘤誘導(dǎo)的減少，并增加淋巴細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞的殺傷活性，而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Liu Yuetao等[5]報(bào)道從羅薩金櫻子果實(shí)中提取的總黃酮能 夠降低血漿中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽的含量，對(duì)肝臟具有很好的保護(hù)作用。黃酮的開發(fā)與應(yīng)用已成為食品、醫(yī)藥、生物工程、化工等領(lǐng)域的重要研究方向[6]。但有關(guān)蘆蒿總黃酮提取物的系統(tǒng)毒性研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蘆蒿總黃酮提取物進(jìn)行了急性毒性及遺傳毒性研究，為合理開發(fā)利用蘆蒿總黃酮提取物資源以及臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿總黃酮提取物由南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院食品工程教研室提供。

鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型突變株TA97、TA98、TA100和TA102，由南京醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用毒理學(xué)研究所提供。

昆明種小白鼠（Ⅱ級(jí)），動(dòng)物合格證號(hào)：CXK蘇2007700001，體質(zhì)量18～25 g，由南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

環(huán)磷酰胺（產(chǎn)品批號(hào)：06032021） 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；小牛血清 杭州四季青公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀KQ.250B 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；尼康50I熒光顯微鏡（配CCD和圖像分析系統(tǒng)）日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆蒿總黃酮提取物的制備

稱取適量的蘆蒿干粉，加入70%的乙醇，料液比為1∶120（m/V），加入微波儀，微波功率400 W，微波時(shí)間3 min，得提取液，經(jīng)抽濾，冷凍干燥得蘆蒿總黃酮提取物。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品通過紫外分光光度法計(jì)算得出提取物中總黃酮的含量為4.31%。

1.3.2 小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～25 g，在室溫（22±3）℃，濕度30%～70%，自由攝食、飲水的飼養(yǎng)條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分成5組，每組10只，其中第Ⅰ～Ⅳ組為實(shí)驗(yàn)組，第Ⅴ組為空白對(duì)照組，正式給藥前禁食8 h，不禁水。稱量各組小鼠體質(zhì)量，記錄。采用改良寇氏法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的劑量，Ⅰ～Ⅳ組分別以1.5、3、6、12 g/kg，4個(gè)不同劑量組進(jìn)行灌胃，分3次灌胃給予溶解于蒸餾水中的蘆蒿總黃酮提取物，間隔8 h?？瞻讓?duì)照組分3次灌服相同體積的蒸餾水。給藥后正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。每天觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)、大小便、精神等全身反應(yīng)狀況及死亡情況，并及時(shí)記錄。第14天時(shí)稱量各組小鼠體質(zhì)量后，剖檢存活小鼠，觀察主要臟器是否有病變[7-8]。

1.3.3 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～25 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，設(shè)陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。其中陰性對(duì)照組經(jīng)口灌服蒸餾水，陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺45 mg/kg腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組以蘆蒿總黃酮提取物分別按500、3 000、12 000 mg/kg進(jìn)行灌胃給藥。連續(xù)給藥2次，間隔24 h。在第2次給予受試藥物后6 h，將小鼠脫頸處死，取小鼠兩側(cè)股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉碎片，剪去股骨兩端，用注射器吸取小牛血清約0.05 mL反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次[9]。將沖洗液滴在載玻片上推片。每個(gè)股骨推片5張，自然干燥。在干燥的玻片上滴加1滴甲醇，自然干燥。將固定好的涂片用1∶10的姬姆薩氏-磷酸鹽緩沖液（pH 6.4）染色25 min，用蒸餾水沖洗，干燥備檢。嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟正染紅細(xì)胞呈紅色。每只小鼠需計(jì)數(shù)2 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，并計(jì)算含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，取其平均值,在一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)微核，仍按一個(gè)微核細(xì)胞計(jì)算。微核率按式（1）計(jì)算[10]，并以千分率表示。

1.3.3.2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)

取雄性小鼠5 0只，隨機(jī)分為5組，體質(zhì)量18～25 g，每組10只，設(shè)陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組采用蘆蒿總黃酮提取物經(jīng)灌胃染毒，染毒劑量分別為500、3 000、12 000 mg/（kg·d）， 每天按時(shí)給藥，連續(xù)5 d，陰性對(duì)照組灌服同體積蒸餾水，陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺20 mg/（kg·d）腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d。于染毒后第35天取樣，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出二側(cè)副睪，放入盛有1 mL磷酸鹽緩沖液的平皿中。用眼科剪將副睪剪碎，靜置5 min后輕輕搖動(dòng)。用4層擦鏡紙濾去組織碎片[7-8]。濾液以1 000 r/min離心5 min，去除大部分上清液，剩約0.5 mL液體與沉淀物搖勻后，用滴管吸取1滴將其滴于潔凈的載玻片上，涂片，每只小鼠涂5張玻片，在空氣中干燥后，用甲醇固定5 min。干燥后用2%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥備檢。每張玻片需計(jì)數(shù)200個(gè)精子，取其平均值，精子畸形率按式（2）計(jì)算[7]。

1.3.3.3 骨髓細(xì)胞染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)

取小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～25 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，設(shè)陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。其中陰性對(duì)照組經(jīng)口灌服蒸餾水，陽性對(duì)照組采用環(huán)磷酰胺20 mg/kg腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組以蘆蒿總黃酮提取物分別按1.2、120、12 000 mg/（kg·d）進(jìn)行灌胃給藥。每天1次，連續(xù)5 d。在處死動(dòng)物前2～3 h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg。頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出雙側(cè)股骨，去肌肉，擦凈血污，剪開兩端關(guān)節(jié)面，用注射器吸磷酸鹽緩沖液5 mL沖出骨髓于離心管中，1 500 r/min，離心10 min，去上清。加入適量預(yù)熱37℃ KCl，混勻，37℃低滲15 min，再加固定液2 mL，混勻，1 000 r/min離心10 min，去上清。再加入固定液4 mL混勻，室溫放置15 min，然后1 000 r/min離心10 min，去上清。重復(fù)一次，去上清，留約0.5 mL。將細(xì)胞懸液滴于冰凍載玻片上，干燥，用10% Giemsa染液染色15 min，用蒸餾水沖洗，干燥備檢。每只動(dòng)物觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)算染色體畸變率。

1.3.3.4 Ames試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)菌株為經(jīng)過鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102。實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法。蘆蒿總黃酮提取物設(shè)8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個(gè)組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（二甲基亞砜）和陽性對(duì)照組（2-氨基芴、1,8-二羥基蒽醌、ICR-191、柔毛霉素、疊氮化鈉、絲裂霉素C），每種菌株每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)3皿平行，在加S9和不加S9條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)回復(fù)突變菌落數(shù)，以超過溶劑對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)的2倍且有劑量-反應(yīng)關(guān)系作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性分析

在灌服不同劑量的蘆蒿總黃酮提取物后各組小鼠外觀特征基本正常，未見毛色差、精神萎靡、毛松等異常表現(xiàn)，也未見耳、眼、口、鼻有異樣分泌物，呼吸道反應(yīng)正常，未見咳嗽、哮喘現(xiàn)象，四肢活動(dòng)和走動(dòng)正常，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各小鼠狀態(tài)無明顯差異，各組小鼠未見死亡。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未見小鼠出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。各組小鼠平均體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異不顯著，見表1。剖解小鼠，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比主要內(nèi)臟器官均未出現(xiàn)肉眼可見的明顯病變。

表1 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（Table 1 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengenssiiss on body weight of mice

表1 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（Table 1 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengenssiiss on body weight of mice

組別0 d體質(zhì)量/g14 d體質(zhì)量/g體質(zhì)量增加量/g實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（1.5 g/kg） 21.00±1.1726.98±1.025.98±1.28實(shí)驗(yàn)Ⅱ 組（3 g/kg）21.63±1.2827.38±1.695.75±1.37實(shí)驗(yàn)Ⅲ組（6 g/kg）20.30±2.6126.75±1.446.45±2.12實(shí)驗(yàn)Ⅳ組（12 g/kg）22.73±1.9128.50±2.365.77±2.32空白對(duì)照Ⅴ組（蒸餾水）22.15±2.0428.82±2.316.67±2.06

2.2 遺傳毒性分析

2.2.1 小鼠骨髓細(xì)胞微核分析

于第2次染毒后6 h將各組小鼠全部處死，取骨髓細(xì)胞液涂片，鏡檢并計(jì)算微核率。結(jié)果見表2。

表2 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠骨髓微核率的影響（x±s，n==1100）Table 2 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengennssiiss on mouse bone marrow micronucleus rate (x ±s,, n = 1100))

圖1 帶微核的嗜多染紅細(xì)胞（a）和不帶微核的嗜多染紅細(xì)胞（b）（×440000）Fig.1 PCE (a) with micronucleus and normal PCE (b) (× 400)

經(jīng)檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比差異不顯著，各實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比差異極顯著，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異均不顯著，見表2、圖1。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，蘆蒿總黃酮提取物無致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的作用。

2.2.2 小鼠精子畸形分析

于最后一次染毒后第35天將小鼠全部處死，取附睪精子涂片，計(jì)算精子畸形率。結(jié)果見表3。

表3 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)雄性小鼠精子的影響Table 3 Effect of total flavonoids extract ofArtemisia selengenssiiss on sperm number and quality in male mice

表3 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)雄性小鼠精子的影響Table 3 Effect of total flavonoids extract ofArtemisia selengenssiiss on sperm number and quality in male mice

組別檢查精子數(shù)畸形精子數(shù)畸形率/%陰性對(duì)照組（蒸餾水）10×200361.8±1.02*實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（500 mg/kg）10×200321.6±1.32*實(shí)驗(yàn)Ⅱ組（3 000 mg/kg）10×200402.0±1.53*實(shí)驗(yàn)Ⅲ組（12 000 mg/kg）10×200381.9±1.41*陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺20 mg/kg）10×2001427.1±1.68

圖2 不同精子放大圖片（×4000）Fig.2 Normal sperm (a), tailless sperm (b), no hook sperm (c) and double tail sperm (d) （× 400）

經(jīng)檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比差異不顯著，各實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比差異極顯著，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異均不顯著，見表3、圖2。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠精子無致畸變作用。

2.2.3 骨髓細(xì)胞染色體畸變分析

每只小鼠觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，結(jié)果見表4。

表4 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響（x =1Table 4 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on chromosome aberration rate of bone marrow cells in mic

表4 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率的影響（x =1Table 4 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on chromosome aberration rate of bone marrow cells in mic

組別檢查染色體數(shù)畸形染色體數(shù)畸形率/%陰性對(duì)照組（蒸餾水）10×100161.6±1.13*實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（1.2 mg/kg）10×100 151.5±1.24*實(shí)驗(yàn)Ⅱ組（120 mg/kg）10×100161.6±1.62*實(shí)驗(yàn)Ⅲ組（12 000 mg/kg）10×100191.9±1.36*陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺20 mg/kg）10×10018718.7±7.68

經(jīng)檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比差異不顯著，各實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比差異極顯著，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異均不顯著，見表4、圖3。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞染色體無致畸作用。

2.2.4 Ames試驗(yàn)結(jié)果分析

圖3 骨髓染色體放大圖片（×400）Fig.3 Normal b one marrow chromosome (a), bone marrow chromosome number reduction (b), and bone marrow tetravalent chromosome (c) (× 400)

表5 蘆蒿總黃酮提取物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌回變菌落數(shù)的影響Table 5 Effect of total flavonoids extract of Artemisia selengensis on Salmonella typhimurium revertant colonies

由表5可知，在加或不加S9的條件下，不同劑量受試物的回復(fù)突變菌落數(shù)與溶劑對(duì)照組相近，均未達(dá)到溶劑對(duì)照組的2倍，陽性對(duì)照物顯示出明顯的誘變性。表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，在加或不加S9的條件下，蘆蒿總黃酮提取物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型4株菌株均無致突變作用。

3 討 論

蘆蒿富含黃酮等活性物質(zhì)，對(duì)降血壓、降血脂、緩解心血管疾病均有較好的食療作用，是一種典型的保健蔬菜[12]。總黃酮作為蘆蒿的主要活性成分，具有抗過敏、抗致癌、抗糖尿病、抗腫瘤和保肝作用[13-16]。深化總黃酮的研究，將有助于進(jìn)一步開發(fā)總黃酮在食品保健和抗癌、心血管保護(hù)等作為治療藥物方面的應(yīng)用前景，帶來更大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

急性毒性實(shí)驗(yàn)研究是評(píng)價(jià)藥物安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用改良寇氏法通過小鼠經(jīng)口給藥設(shè)計(jì)了急性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察了蘆蒿總黃酮提取物的急性毒性。灌胃的最大劑量達(dá)到12 g/kg體質(zhì)量，超過了安全劑量10 g/kg體質(zhì)量以上，小鼠沒有發(fā)生死亡情況且生長(zhǎng)情況良好，體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，由此證明蘆蒿總黃酮提取物未干擾小鼠代謝系統(tǒng)，未影響食物的吸收利用。剖檢存活小鼠后，未見心、肝、脾、肺、腎等主要內(nèi)臟器官出現(xiàn)肉眼可見的病變， 由此證明短期內(nèi)蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠安全，可認(rèn)為該受試物急性毒性實(shí)驗(yàn)是安全的，不必測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50），表明蘆蒿總黃酮提取物屬于實(shí)際無毒類[7]。

小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和染色體畸變實(shí)驗(yàn)可以反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體的作用能力，以檢測(cè)致突變物對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷情況[17-19]。小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)可以用來判斷受試物是否造成了精子功能障礙，反映了生殖系統(tǒng)在外來誘變劑作用下的變異現(xiàn)象。這3項(xiàng)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明蘆蒿總黃酮提取物對(duì)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞沒有致突變性。

Ames 試驗(yàn)根據(jù)遺傳學(xué)終點(diǎn)分屬于基因突變，它是檢測(cè)環(huán)境誘變劑一組實(shí)驗(yàn)中的首選實(shí)驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于致突變化學(xué)物的初篩[20]。在加或不加S9的條件下，蘆蒿總黃酮提取物Ames 試驗(yàn)的結(jié)果都為陰性，說明蘆蒿總黃酮提取物既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性。

綜上所述，蘆蒿總黃酮提取物對(duì)小鼠無急性毒性及遺傳毒性作用，在食品保健和治療藥物方面很有開發(fā)前景。

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Acute and Genetic Toxicity of Total Flavonoids Extract of Artemisia selengensis

W U Yu-long, HUA Chun*, FU Qing-quan, WU Xiang-hua
(School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China)

Objective: To evaluate the safety of total flavonoids extract of Artemisia selengensis for consumption. Methods: Acute toxicity test, micronuclear test in polychromatic erythrocytes of bone marrow and sperm abnormality in mice, bone marrow chromosome aberration test in mice and Ames test were conducted to investigate the acute and genetic toxicity of the total flavonoids extract. Results: For the acute toxicity, the LD50was > 10 g/kg. No apigenin-related genetic toxicity was observed. Conclusion: Under the conditions of this experiment, the total flavo noids extract has neither acute nor genetic toxicity.

Artemisia selengensis; total flavonoids; acute toxicity; genetic toxicity

R114

A

1002-6630（2014）07-0206-05

10.7506/spkx1002-6630-201407041

2013-05-04

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA021701）；南京曉莊學(xué)院校級(jí)應(yīng)用型項(xiàng)目（2011NXY06）

吳雨龍（1980—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)和藥理學(xué)。 E-mail：xiaoyatou422@sina.com

*通信作者：華春（1963—），女，教授，本科，研究方向?yàn)橹参锷韺W(xué)。E-mail：hc3501988@ 163.com