池愛平，李 虹，康琛喆，郭歡歡，張海猛，郭 飛，王一民

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

富硒茶多糖的提取及其對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)的影響

池愛平，李 虹，康琛喆，郭歡歡，張海猛，郭 飛，王一民

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

目的：研究紫陽富硒茶多糖（selenium-rich tea polysaccharide，STP）的基本理化性質(zhì)及其對(duì)小鼠游泳能力與疲勞恢復(fù)的影響。方法：采用水提醇沉法提取STP，對(duì)其基本成分含量、紫外和紅外光譜進(jìn)行了檢測(cè)；同時(shí)建立了一個(gè)5 周的小鼠耐力運(yùn)動(dòng)模型，灌胃不同劑量的STP水溶液，測(cè)定了小鼠的游泳力竭時(shí)間，然后分別在小鼠在力竭運(yùn)動(dòng)即刻、運(yùn)動(dòng)后24 h恢復(fù)兩 種情況下取材，測(cè)定了血糖、血尿素氮、血乳酸的濃度以及肝糖原含量、肝谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。結(jié)果：STP是一種含蛋白的硒多糖，對(duì)小鼠游泳 力竭時(shí)間有明顯的延長作用；對(duì)于小鼠的糖代謝能力具有調(diào)節(jié)作用，而且顯著提高小鼠肝組織的GSH-Px活性，降 低MDA的含量。結(jié)論：STP具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，其機(jī)理與其調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝和改善運(yùn)動(dòng)造成機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

富硒茶多糖；力竭運(yùn)動(dòng)；運(yùn)動(dòng)疲勞

目前關(guān)于耐力運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的機(jī)制有眾多理論支持：諸如能源物質(zhì)消耗學(xué)說、自由基氧化學(xué)說、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)學(xué)說、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說以及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說等[1]。所以，通過有針對(duì)性地補(bǔ)充外源性營養(yǎng)補(bǔ)劑或者藥物活性成分，來延緩或者緩解運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，是解決運(yùn)動(dòng)性疲勞的有效途徑之一。研究表明，許多植物的多糖成分具有改善運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，其作用機(jī)制大多與提高機(jī)體糖儲(chǔ)備以及提高機(jī)體免疫能力等方面有關(guān)，故多糖抗運(yùn)動(dòng)性疲勞方面的研究成為近幾年運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域研究一個(gè)熱點(diǎn)[2-4]。硒具有多種生理功能，它不僅是谷胱甘肽過氧化物酶活性中心的組成部分，還能夠維持機(jī)體的正常免疫功能[5]。硒是人體特別是運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)易缺乏的微量元素。多糖類物質(zhì)目前被證明具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、改善糖代謝以及抗氧化功能。研究發(fā)現(xiàn)硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒[6]，此外也有研究證明硒多糖具有明顯的調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用[7-8]。紫陽縣是我國高富硒地區(qū)之一，每年產(chǎn)2 200 t富硒茶，來源豐富但開發(fā)利用率低。紫陽富硒茶中的硒含量豐富，主要以有機(jī)態(tài)的形式與蛋白質(zhì)或者多糖結(jié)合在一起[9]，是一種理想的補(bǔ)硒、補(bǔ)多糖的途徑。人們通過飲用富硒茶或者服用茶制品來達(dá)到多種保健目的，但至今未見富硒茶與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的研發(fā)產(chǎn)品，甚至與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的研究報(bào)道也極少，因此，本課題以耐力運(yùn)動(dòng)疲勞的特殊生理現(xiàn)象和富硒茶多糖的生物活性為研發(fā)的理論依據(jù)，在實(shí)驗(yàn)中，采用水提醇沉法，提取了紫陽富硒茶多糖（selenium-rich tea polysaccharide，STP），建立了小鼠5 周的耐力運(yùn)動(dòng)模型，通過服用不同劑量的STP溶液，來檢測(cè)STP對(duì)小鼠耐力運(yùn)動(dòng)、行為學(xué)表現(xiàn)與疲勞恢復(fù)的影響程度，旨在為進(jìn)一步開發(fā)運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑提供實(shí) 驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康昆明種雄性小鼠，2 月齡，體質(zhì)量22～26 g，由陜西省交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心購入，同時(shí)購入基礎(chǔ)飼料。

富硒茶由陜西省紫陽縣閩秦茶葉有限公司提供。

乙醇、三氯甲烷、丙酮、乙醚 天津化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫、濃硫酸 西安化學(xué)試劑廠；以上試劑均為AR級(jí)；硒粉 西安順達(dá)化學(xué)試劑儀器公司；透析袋（Mw10 000） 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752B型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；U-3900/3900H紫外光譜儀 日立公司；Tensor27紅外光譜儀 德國布魯克公司；DD5低溫高速離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 STP的提取

圖1 STP提取流程圖Fig.1 Flow chart of STP extraction

STP的提取過程參照文獻(xiàn)[10]采用的水提醇沉法，并做改良，游離蛋白的去除采用Sevag法。流程圖見圖1。

1.3.2 STP主要成分測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[11]。硒含量測(cè)定采用紫外分光光度法[12]。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用雙縮脲法[13]。

1.3.3 STP的紫外光譜采集

稱取STP 5 mg，配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸餾水為對(duì)照，在紫外光譜儀190～600 nm波長區(qū)域內(nèi)掃描。

1.3.4 STP的紅外光譜采集

稱取STP 3 mg，分別于400 mg干燥的KBr混勻，在瑪瑙研缽中研磨5 min，壓片，在紅外光譜儀上測(cè)定4 000～400 cm-1的紅外光譜。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立

動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為12～18 ℃，相對(duì)濕度為43%～50%，光照隨同自然光變化。將小鼠隨機(jī)分為4 組：空白對(duì)照組（A組）、陽性對(duì)照組（B組）、STP低劑量組（C1組）和高劑量組（C2組），每組20 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 運(yùn)動(dòng)模型的建立

各組小鼠在塑料水池（長×寬×高為：80 cm×60 cm×50 cm，水溫30 ℃，水深40 cm）進(jìn)行為期5周的游泳訓(xùn)練，每周的周一至周六每晚8點(diǎn)進(jìn)行90 min的尾部負(fù)重（負(fù)荷為體質(zhì)量的5%）游泳訓(xùn)練，周日休息，最后一周的周六訓(xùn)練改為負(fù)重力竭游泳（力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)：以小鼠頭部沉入水中5 s不能浮出水面）。每次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后進(jìn)行灌胃：C1和C2組小鼠分別灌胃劑量為100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）的STP水溶液；A組小鼠灌胃等體積的生理鹽水；B組為陽性對(duì)照組，灌胃蔗糖水溶液，劑量參照文獻(xiàn)[14]為6 g/（kg·d）。灌胃時(shí)間為30 d。

1.3.7 血液與肝組織部分生化指標(biāo)的測(cè)定

記錄小鼠力竭時(shí)間，力竭游泳結(jié)束后，立刻在每組小鼠中隨機(jī)選擇一半，進(jìn)行采血處死取材。測(cè)定項(xiàng)目包括：血糖、血乳酸、血尿素氮的濃度；肝糖原、肝組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量以及肝組織谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性。每組剩余的一半小鼠恢復(fù)24 h后，進(jìn)行采血處死取材，測(cè)定相同項(xiàng)目。測(cè)定均使用南京建成生物制劑公司生產(chǎn)的試劑盒，按照說明操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 STP的基本理化性質(zhì)

采用水提醇沉法從1 000 g富硒茶原料中提取STP 39.7 g，得率為3.97%，與原料的主要成分對(duì)比結(jié)果見表1。

從表1中STP與茶原料的成分含量對(duì)比來看，總糖含量與硒含量明顯增加，蛋白質(zhì)含量下降，原因主要是本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法除去了原料中游離蛋白。

圖2 STP的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectrum of STP

紫外光譜圖（圖 2）顯示STP在280 nm左右有強(qiáng)吸收峰，表明STP含有結(jié)合蛋白，這與表1結(jié)果相一致，屬于蛋白多糖。紅外光譜圖（圖3）顯示：STP屬于典型的多糖結(jié)構(gòu)，在3 438.22 cm-1處的吸收峰表示O—H伸縮振動(dòng)，在1 639.09 cm-1處的吸收峰表示C=O或者O—CHO伸縮振動(dòng)，在1 393.81 cm-1處的吸收峰表示C—H伸縮振動(dòng)，在1 111.16 cm-1處的吸收峰表示C—O伸縮振動(dòng)，在850.89 cm-1處的弱吸收峰表示STP含有少量α-D-吡喃糖，在887.89 cm-1處的弱吸收峰表示STP還含有少量β-D-吡喃糖。

圖3 STP的紅外光 譜Fig.3 Infrared spectrum of STP

圖4 小鼠力竭游泳時(shí)間對(duì)比（n=20）=20Fig.4 Comparison of swimming exhaustion time in mice (n = 20)

2.2 各組小鼠力竭游泳時(shí)間的比較由圖4可知，蔗糖組小鼠的 力竭時(shí)間與空白對(duì)照組相比較顯著延長（P＜0.05），STP高劑量組小鼠的力竭時(shí)間與空白對(duì)照組相比較極顯著延長（P＜0.01），說明蔗糖和高劑量的STP對(duì)小鼠的力竭疲勞的時(shí)間具 有延緩的作用，但二者之間沒有顯著性差別。

2.3 各組小鼠血液部分生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表2 小鼠血液生化指標(biāo)的比較（x±s，n=10）Table 2 Comparison of blood biochemical indexes in mice (x±s , n = 10)

由表2可知，從運(yùn)動(dòng)后即刻各組小鼠的血糖濃度比較來看，只有STP高劑量組顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h，各組之間小鼠的血糖濃度比較無顯著性差異，但與同組運(yùn)動(dòng)即刻相比較，均有顯著或極顯著地升高（P＜0.05，P＜0.01）。由于力竭運(yùn)動(dòng)的能量需求使小鼠的血糖濃度在運(yùn)動(dòng)時(shí)降低，在24 h恢復(fù)后，各組小鼠血糖恢復(fù)良好，但組間沒有顯著性差異，這與機(jī)體血糖動(dòng)態(tài)平衡性有關(guān)系。在各組小鼠血尿素氮濃度的比較中，蔗糖組和STP高、低劑量組較空白對(duì)照組有不同程度的降低，說明這蔗糖和STP參與供能后，都能使小鼠的蛋白質(zhì)分解代謝有明顯的節(jié)省現(xiàn)象。在同組恢復(fù)前后的對(duì)比中，除了空白對(duì)照組之外，其他各組小鼠血尿素氮都有顯著性的降低（P＜0.05）。組間血乳酸含量的對(duì)比中，蔗糖組和STP高、低劑量組小鼠在運(yùn)動(dòng)后即刻，都明顯比空白對(duì)照組小鼠的血乳酸含量低（P＜0.05）；而在同組之間的比較，運(yùn)動(dòng)恢復(fù)24 h比運(yùn)動(dòng)即刻，各組小鼠血乳酸濃度都極顯著性地降低（P＜0. 01）。說明血乳酸能在較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。

2.4 各組小鼠肝組織部分生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表3 小鼠肝組織部分生化指標(biāo)比較（x±s，n=10）Table 3 Comparison of liver tissue biochemical indexes in mice (x ±s,n=10)

由表3可知，運(yùn)動(dòng)后即刻組間肝糖原含量的對(duì)比，均沒有顯著性差異，這與力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致各組小鼠機(jī)體肝糖原耗盡有關(guān)。但在24 h的恢復(fù)后，各組小鼠肝糖原均有顯著性的恢復(fù)（P＜0.05），蔗糖組與STP高劑量組的恢復(fù)情況較空白對(duì)照組更明顯（P＜0.05）。在肝組織GSH-Px活性的對(duì)比中，不管是運(yùn)動(dòng)即刻組還是運(yùn)動(dòng)恢復(fù)組，STP組小鼠GSH-Px活性均不同程度高于空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），而同組相比較，小鼠GSH-Px活性均顯著性下降（P＜0.05）。同組MDA含量的對(duì)比中，各組小鼠運(yùn)動(dòng)恢復(fù)后比運(yùn)動(dòng)即刻的MDA含量均有顯著或極顯著地降低（P＜0.05，P＜0.01），但組間比較時(shí)，STP組在運(yùn)動(dòng)即刻時(shí)和恢復(fù)24 h后，MDA含量顯著低于空白對(duì)照組和蔗糖組（P＜0.05），這可能與STP提高了小鼠肝組織GSH-Px活性有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過一系列的提取與純化，本實(shí)驗(yàn)得到的富硒茶多糖的活性成分包括糖、結(jié)合蛋白和硒的含量都大幅度提高，結(jié)果證明富硒茶多糖是一種含硒蛋白多糖，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能決定富硒茶多糖具有某些活性功能，這有待于進(jìn)一步研究。

運(yùn)動(dòng)性疲勞是一個(gè)極其復(fù)雜的身體變化綜合反應(yīng)過程。研究證明在長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，糖原耗盡、血糖濃度降低、乳酸堆積都能誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生[15]。單糖與雙糖易被消化系統(tǒng)吸收，能夠迅速提高機(jī)體的糖原恢復(fù)與儲(chǔ)備，進(jìn)而改善運(yùn)動(dòng)后疲勞的恢復(fù)。目前在運(yùn)動(dòng)性疲勞與補(bǔ)糖的研究中，蔗糖是主要的補(bǔ)糖種類之一[16-17]，故本實(shí)驗(yàn)選用補(bǔ)充蔗糖作為陽性對(duì)照組。運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生還與氧化損傷、內(nèi)環(huán)境改變、免疫機(jī)能下降以及機(jī)體保護(hù)性抑制等多重因素有關(guān)[1]，故在運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑的研究方面應(yīng)予以多重因素考慮。多糖由于分子質(zhì)量大，不易被消化系統(tǒng)吸收，但眾多研究證明，多糖可以改善腸道黏膜免疫系統(tǒng)，間接提高機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能[18-20]。另外，也有研究證明一些多糖能夠改善機(jī)體運(yùn)動(dòng)造成的氧化損傷[21-22]。這說明，補(bǔ)充多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的作用機(jī)理，可能與其改善了機(jī)體的免疫功能和抗氧化能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，高劑量的STP對(duì)小鼠的力竭疲勞的時(shí)間具有延緩的作用，與陽性對(duì)照組作用效果相似。但二者的作用途徑與機(jī)理可能不同。

本實(shí)驗(yàn)選用3 個(gè)血液生化指標(biāo)：血糖、血尿素氮、血乳酸，都能夠間接反映運(yùn)動(dòng)疲勞程度的血液生化指標(biāo)[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血糖的變化不明顯，可能與血糖的動(dòng)態(tài)平衡性有關(guān)。而血尿素氮是反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的一個(gè)指標(biāo)，一般在長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，糖原儲(chǔ)備不足的情況下，蛋白質(zhì)參與代謝的程度增大，本實(shí)驗(yàn)證明，補(bǔ)充蔗糖和STP后，對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝具有一定的節(jié)省作用。乳酸含量在另外一方面反映了糖進(jìn)行無氧酵解的程度，也是反映機(jī)體有氧代謝能力的一個(gè)指標(biāo)[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充蔗糖和STP后，機(jī)體乳酸含量較對(duì)照組降低，說明蔗糖和STP促進(jìn)了機(jī)體糖的有氧代謝能力。肝糖原儲(chǔ)備水平是反映機(jī)體的有氧代謝能力和疲勞程度的重要指標(biāo)[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充蔗糖和高劑量的STP后，對(duì)于肝糖原的恢復(fù)具有顯著的增強(qiáng)作用。

力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)使機(jī)體自由基產(chǎn)生增多，抗氧化酶因受到自由基的傷害導(dǎo)致活性下降，使機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度增加，其產(chǎn)物MDA可以反映組織的脂質(zhì)過氧化的程度。GSH-Px是一種含硒蛋白，能夠清除脂類氫氧化物和有機(jī)氫過氧化物，減輕機(jī)體損傷，在氧化防御反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，在一定程度上阻止機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度[25-26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，服用STP后，不管在運(yùn)動(dòng)即刻還是在運(yùn)動(dòng)恢復(fù)后，小鼠肝組織中GSH-Px活性均顯著升高，而MDA含量顯著下降，這與STP中的硒有關(guān)，硒為機(jī)體合成GSH-Px提供了必要的材料，最終對(duì)于機(jī)體由于過度運(yùn)動(dòng)造成的脂質(zhì)過氧化具有保護(hù)作用。雖然蔗糖和STP同樣具有延緩小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的作用，但STP在提高抗氧化酶的層面上，對(duì)機(jī)體組織的氧化損傷保護(hù)中，具有積極地意義。這也正是積極開發(fā)富硒茶多糖的目的所在。關(guān)于STP在免疫學(xué)層面上是否對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生影響，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

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Extraction of Polysaccharides from Selenium-Rich Tea and Their Influence on Fatigue and Recovery after Exercise

CHI Ai-ping, LI Hong, KANG Chen-zhe, GUO Huan-huan, ZHANG Hai-meng, GUO Fei, WANG Yi-min
(School of Sports, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective: To evaluate the physical and chemical properties of polysaccharides from selenium-rich tea and the effects of these polysaccharides on swimming performance and recovery from swimming-induced fatigue in mice. Methods: The polysaccharides were extracted by using the method of water extraction and alcohol precipitation. The proximate composition and ultraviolet and infrared spectral characteristics of selenium-rich tea polysaccharides (STPs) were tested. At the same time, a 5-week endurance exercise model in mice was established, and the mice were given by oral gavage different doses of STPs. The swimming exhaustion time of mice was recorded and the concentrations of blood glucose, blood urea nitrogen (BUN), blood lactic acid (BLA) and the contents of hepatic glycogen and malonaldehyde (MDA) as well as the activity of hepatic glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured immediately and at 24 h after exhaustive exercise. Results: STPs were Se-binding glycoproteins and could prolong the swimming exhaustion time, improve the carbohydrate metabolism, significantly increase the activity of GSH-Px and reduce the content of MDA in liver tissue of mice. Conclusion: STPs have an anti-fatigue effect in mice and the underlying mechanism is related to regulating the carbohydrate metabolism and improving tissue lipid peroxidation caused by excessive exercise.

selenium-rich tea polysaccharide (STP); exhaustive exercise; exercise-induced fatigue

G804.7

A

1002-6630（2014）13-0240-05

10.7506/spkx1002-6630-201413047

2014-04-11

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（GK201402046）；陜西師范大學(xué)“211工程”項(xiàng)目（2010-93）；陜西師范大學(xué)體育學(xué)院青年教師科研基金項(xiàng)目（2013140）

池愛平（1972—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)營養(yǎng)與健康。E-mail：chimu@snnu.edu.cn