黃文勝，傅 凱，鄧婷婷，李富威，劉 昊，陳 穎

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

應(yīng)用多重PCR-液相懸浮芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系

黃文勝，傅 凱，鄧婷婷，李富威，劉 昊，陳 穎*

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

開展轉(zhuǎn)基因水稻的多重聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）液相芯片檢測方法研究。針對科豐6號（KF6）、科豐8號（KF8）、華恢1號（BT63）、克螟稻（KMD1）、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九種轉(zhuǎn)基因水稻的側(cè)翼序列，設(shè)計合成了在生物素標記的多重PCR擴增引物與固定在熒光編碼微球上的探針，建立了2 個多重PCR-液相芯片檢測體系，可同時檢測出這9 種轉(zhuǎn)基因水稻成分。結(jié)果表明，9 種轉(zhuǎn)基因水稻的引物和探針都具有較高的特異性，各組引物/探針之間無交叉擴增和非特異雜交，且在多重PCR-液相芯片檢測中9 種轉(zhuǎn)基因水稻品系的相對檢測靈敏度達到0.1%水平，符合歐盟和其他國家有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識的要求。本方法的檢測效率和準確性均高于傳統(tǒng)方法，可作為進出口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和國內(nèi)轉(zhuǎn)基因檢測的有效方法。

多重PCR；液相芯片；轉(zhuǎn)基因水稻；檢測

轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進展迅速，各國科學家累計將超過30 種外源基因轉(zhuǎn)入各個亞種的水稻中。迄今為止，全球已有5 種轉(zhuǎn)基因水稻獲準田間種植，如抗草丁膦轉(zhuǎn)基因水稻LL62、LL601分別于1999年和2006年在美國獲準種植。然而，許多國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有市場準入要求，未獲允許不得生產(chǎn)和銷售。但在糧食生產(chǎn)加工和流通環(huán)節(jié)難免發(fā)生轉(zhuǎn)基因大米污染，如2005年綠色和平組織在湖北發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻非法種植和銷售，2006年歐盟從中國米制品中檢出“BT63”成分，2007年歐盟從進口美國長粒米中檢出轉(zhuǎn)基因大米LL601等，這些污染事件給相關(guān)出口國造成重大損失。我國的米和米制品年出口額達數(shù)億美元，同時我國也是重要的大米進口國，2012年從越南、泰國、印度、巴基斯坦等進口稻谷和大米236.9萬t[1-3]。為防止轉(zhuǎn)基因大米非法進出口，我國出入境檢驗檢疫部門依法對進出口大米和米制品進行轉(zhuǎn)基因檢驗[4-5]。當前多數(shù)國家采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大米成分，同時探索液相芯片和等溫擴增等相關(guān)方法[6-10]。王渭霞等[11-12]應(yīng)用實時定量PCR檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號，靈敏度達0.1%。但PCR方法的檢測通量較低，為提高檢測效率，F(xiàn)antozzi[9]和Chois[13]等首先將液相芯片技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的篩選檢測，特異性和效率高于PCR方法。液相芯片技術(shù)以熒光編碼微球為基礎(chǔ)，微球有直徑約5.6 μm的聚苯乙稀塑料微球和6.5 μm的磁性微球兩種類型，其表面帶有大量的活性基團，可與核酸探針、抗原、抗體等分子偶聯(lián)。微球在生成過程中帶上紅色和橙色兩種突光染料，兩種染料分別有10 個區(qū)分的不同配比賦予了微球100 種不同的顏色，產(chǎn)生了 100 種不同光譜學指紋的微球體，每種微球特異性的偶聯(lián)針對目的DNA序列的寡核苷酸探針，就可以標記100 種不同的探針分子，液相芯片的檢測系統(tǒng)內(nèi)置兩束波長不同激光發(fā)射器，其中一束激光用來激發(fā)熒光微球自身的熒光物質(zhì)，根據(jù)探測到的熒光微球自身發(fā)出的熒光強度來決定探針分子的特異性（定性）；另一束激光用來激發(fā)報告分子所攜帶的熒光物質(zhì)，通過對報告分子發(fā)出熒光強度的測量，對待檢生物分子進行定量或半定量檢測[14-15]。

本實驗采用多重PCR-液相芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系中外源基因端與水稻基因組DNA的連接區(qū)的的側(cè)翼序列，旨在建立轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性的液相芯片高通量檢測方法，以滿足出入境檢驗和國內(nèi)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管執(zhí)法的需要。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

非轉(zhuǎn)基因水稻購自北京市場；KF6、KF8、BT63、KMD1、M12、T2A-1、T1C-19等轉(zhuǎn)基因水稻種子為中國檢驗檢疫科學研究院所保存；LL62、LL601 美國油脂化學協(xié)會。

HotStarTaq?DNA Polymerase 德國Qiagen公司；dNTPs 日本Takara公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，sds）、Tween-20、四甲基氯化銨（tetramethylammonium chloride，TMAC）美國Sigma公司；鏈霉親和素-藻紅素（streptavidinphycoerythrin，SA-PE） 上海Invitrogen公司；羧基化微球 美國Bio-Rad公司。

Veriti PCR儀 美國AB公司；DYY-6C電泳儀；MixMate混勻儀 德國Eppendorf公司； Bio-PlexTM200液相芯片檢測儀、Vacuum Pump真空抽濾儀 美國Bio-Rad公司；Nano Drop 3300核酸測定儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針

基于外源基因與水稻基因組之間的連接區(qū)域序列，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件分別設(shè)計多對KF6、KF8、T1C-19、T2A-1、BT63、KMD1、M12、LL62和LL601等水稻品系特異性檢測引物，并對引物進行篩選和優(yōu)化。引物長度一般為18～25 個堿基，引物G＋C含量盡可能在40%～60%之間，為了使得液相芯片的雜交效率提高，目的擴增片段最好在100～300 bp之間，下游引物5’端進行生物素標記，目的是與鏈霉親和素化的藻紅蛋白反應(yīng)，帶標記的單鏈擴增片段必須與偶聯(lián)微球的捕獲探針互補，探針長度最好為18～24 bp左右，G＋C含量應(yīng)在40%～60%之內(nèi)，探針必須有一定的空間與目的片段雜交，且有氨基與羧基化的熒光微球偶聯(lián)，所以在5’端進行氨基修飾的C12手臂的標記（5’Minolinker C12），同時針對每條探針設(shè)計反向互補探針（驗證探針），且5’端進行生物素標記，用于驗證偶聯(lián)效率[15]。引物代號、序列和標記等詳細信息見表1。所有引物/探針由上海英駿生物公司合成。

表1 轉(zhuǎn)基因水稻品系檢測使用的引物和探針Table1 Primers and probes used in this study

1.2.2 DNA提取及PCR擴增

水稻基因組DNA的提取采用CTAB分步沉淀法，CTAB 法試劑配制及操作步驟參照Dietrieh Made方法。提取的DNA用Nano Drop核酸測定儀進行質(zhì)量濃度和純度的測定，最后質(zhì)量濃度統(tǒng)一調(diào)整為10 ng/μL，用于后續(xù)單重PCR和多重PCR反應(yīng)。

單重PCR擴增反應(yīng)體系（20 μL）：10×HotStarTaq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0 μL，DNA模板（10 ng/μL）5.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，HotStart酶（10 U/μL）0.2 μL，加滅菌雙蒸水補足體積至20 μL。以水代替DNA模板作為空白對照，以陰性水稻DNA為模板作為陰性對照。PCR反應(yīng)的擴增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結(jié)果。其余4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 液相芯片的檢測

1.2.3.1 微球的偶聯(lián)

微球偶聯(lián)按照Bio-Rad公司的標準操作程序進行：將微球渦旋30 s、超聲振蕩30 s后，取50 μL（6.25×106個）微球于離心管中，離心去上清液；用50 μL 0.1 mol/L MES（pH 4.5）重懸微球，使微球充分分散，加入一定量探針。制備新鮮的EDC溶液（10 mg/mL），加入2.5 μL EDC至加有探針的微球混合物中，充分混勻，室溫避光孵育30 min，然后再加入2.5 μL新鮮配制的EDC溶液，室溫孵育30 min。用1 mL 0.02% Tween-20和1 mL 0.1% SDS各洗滌一次，最后用50 TE緩沖液重懸微球，4 ℃避光保存。

1.2.3.2 液相芯片雜交

雜交體系中各組分為PCR純化產(chǎn)物1.0 μL，1.5×TMAC 33.0 μL，按需要加入偶聯(lián)有不同基因探針的熒光編碼微球0.5 μL，用1×TE補足反應(yīng)體系總體積至50 μL。

液相芯片雜交按照公司推薦步驟進行：雜交通常在PCR儀上進行。先95 ℃變性5 min，然后55℃雜交10 min；雜交完的樣品轉(zhuǎn)到96 孔濾板進行真空抽濾；將SA-PE用TE稀釋到4 ng/μL，每孔加入50 μL，先在混勻儀上以1 100 r/min避光振蕩1 min，然后以550 r/min室溫孵育5 min；抽干濾孔板，然后用TE洗兩次，最后用125 μL TE進行重懸。在液相芯片檢測儀按要求校正和校準后，放入樣品板，對樣品進行熒光檢測。

1.2.3.3 引物、探針特異性檢測

將9 個品系的轉(zhuǎn)基因水稻DNA稀釋至10 ng/μL，設(shè)置陰性與空白對照，進行常規(guī)PCR反應(yīng)（3次實驗重復(fù)）；反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳結(jié)果，統(tǒng)計9 個品系特異性引物的交叉擴增情況。為測試液相芯片品系特異性探針相互之間的交叉反應(yīng)，將9 種偶聯(lián)不同探針的熒光編碼微球依次與每種品系的PCR擴增產(chǎn)物混合，進行雜交反應(yīng)檢測，統(tǒng)計9 個品系特異性探針的交叉反應(yīng)的信號強度。

1.2.3.4 引物、探針的靈敏度檢測

用CTAB法分別提取9種轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻的DNA，并用純水將基因組DNA分別稀釋到10 ng/μL。將各個品系的轉(zhuǎn)基因水稻的DNA進行10 倍梯度稀釋，以此為模板進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳和液相芯片雜交分析，確定針對該品系的絕對靈敏度。將各個品系的轉(zhuǎn)基因水稻的DNA（100%）與非轉(zhuǎn)基因水稻DNA以不同比例稀釋，從而得到不同百分含量的轉(zhuǎn)基因水稻DNA，以此為模板進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳和液相芯片雜交分析確定針對該品系的相對靈敏度。

1.2.3.5 多重PCR-液相芯片品系檢測

根據(jù)9個品系的引物/探針的交叉反應(yīng)情況、PCR擴增效率及PCR-液相芯片檢測的信號強度，將9個品系引物分為2組，進行多重PCR-液相芯片檢測。第1組為KF6、KF8、LL62和LL601分；第2組為T1C-19、T2A-1、BT63、KMD1和M12。多重PCR擴增反應(yīng)體系（20 μL）為：10×HotStar Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl21.0 μL，HotStar酶0.2 μL，引物（適宜濃度），最后加雙蒸水補足體積至20 μL。多重PCR反應(yīng)程序和液相芯片檢測程序同單重PCR。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考Bio-Rad公司推薦方法及相關(guān)文獻[17-18]處理本實驗相關(guān)數(shù)據(jù)。液相芯片中特定探針（微球）的定性臨界值的確定：根據(jù)日常實驗的統(tǒng)計結(jié)果，將探針（微球）的檢測空白對照（以水為模板）PCR產(chǎn)物的校正后的熒光強度中位值（mean fluorescence intensity blank，MFIB）的5 倍確定為定性臨界值，如待測樣品PCR產(chǎn)物的校正后的熒光強度中位值（mean fluorescence intensity samples，MFIS）≥5×MFIB，則判定為樣本檢測結(jié)果陽性，如果3×MFIB≤MFIS＜5×MFIB，則判定為可疑陽性，如果MFIS＜3×MFIB，則判定為檢測結(jié)果為陰性；根據(jù)日常實驗中獲得的經(jīng)驗，設(shè)定液相芯片檢測的質(zhì)控條件為：MFIB＜50，且陰性對照的熒光強度中位值（mean fluorescence intensity negative，MFIN）＜5×MFIB，否則說明PCR試劑或DNA提取過程存在交叉污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物、探針的特異性

轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性引物的單重PCR電泳檢測結(jié)果如圖1所示。9 對引物均可擴出預(yù)期長度的外源片段，且僅在對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻品系樣本中擴增出目的片段，無交叉擴增現(xiàn)象。結(jié)果表明所設(shè)計的9 對引物的特異性符合檢測要求。

圖1 檢測引物的特異性Fig.1 Specificity test of primers for the detection of 9 GM rice lines

9 種品系檢測探針的特異實驗結(jié)果見表2。除個別探針外，大多數(shù)探針的陰性對照和空白對照（以水為模板）的MFI值相近，一般在5～10之間，表明液相芯片檢測的本底信號極低。9 個水稻品系的檢測探針同非靶標品系PCR產(chǎn)物的雜交信號強度接近陰性對照和空白對照，而各探針的靶標品系的MFI值達到846～2 837，是空白對照的90～300 倍，證明這些探針的特異性較強，且熒光信號值較高，符合品系檢測要求。

表2 檢測探針的特異性Table2 Specificity of probes for the detection of 9 GM rice lines

2.2 單重PCR-液相芯片檢測的絕對靈敏度

以10 ng/μL的樣品DNA作為檢測起始質(zhì)量濃度，10 倍梯度稀釋5 次，每個質(zhì)量濃度作3 個平行，以水作為空白對照，進行PCR擴增。取各質(zhì)量濃度的PCR產(chǎn)物1 μL進行液相芯片雜交檢測，MFI值見表3。按照空白對照MFI值的5 倍作為定性檢測的臨界值進行結(jié)果判讀，9 個品系的絕對靈敏度均能達到0.01 ng/μL；其中KF6、T1C-19、T2A-1、KMD1和LL62這5 個品系的絕對靈敏度能達到0.001 ng/μL。說明PCR-液相芯片檢測的靈敏度比PCR-凝膠電泳要高1～2 個數(shù)量級。表3也說明該體系中模板質(zhì)量濃度為1 ng/μL時，探針結(jié)合效率及信號強度可達到飽和。因此，當模板質(zhì)量濃度上升為10 ng/μL時其MFI值出現(xiàn)波動甚至部分品系的MFI值有小幅度下降的現(xiàn)象出現(xiàn)。

表3 單重PCR-液相芯片檢測體系的絕對靈敏度Table3 Absolute sensitivity of simplex-PCR-liquid array

2.3 多重PCR-液相芯片檢測

若待測樣品只需檢測1 種或數(shù)種轉(zhuǎn)基因水稻品系，則單重PCR-液相芯片檢測可以滿足需要，若需同時檢測5 種以上品系，則單重PCR方法過于繁瑣。為在多靶標檢測時減少PCR反應(yīng)的數(shù)量，將9 種水稻品系分為2 組，進行多重PCR擴增。為使各組的每對品系特異性引物同時達到相近擴增效率，對多重PCR體系中各品系特異性引物的使用量進行優(yōu)化，優(yōu)化后的引物濃度見表4。

在每組多重PCR體系中加入相應(yīng)的水稻品系的DNA各10 ng，作為PCR擴增模板，陰性對照以50 ng陰性水稻DNA作為模板，空白對照以純水為模板，進行多重PCR擴增。取多重PCR產(chǎn)物1 μL，進行相應(yīng)的液相芯片的檢測，實驗重復(fù)3 次，取3 次的平均值，兩組多重PCR-液相芯片檢測結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，2 組多重PCR的各品系探針的陽性樣品MFI值都在500以上，陰性和空白對照MFI值都在20以下。BT63的品系探針雜交信號在多重PCR檢測中相對較弱，其他探針都有較強的雜交信號。說明5重PCR-液相芯片檢測相互之間無顯著干擾，多重引物擴增的靈敏度和探針雜交的特異性與單重PCR-液相芯片檢測近似。

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻品系多重PCR液相芯片檢測Fig.2 Detection of 9 GM rice lines with multiplex PCR-liquid chip method

2.4 多重PCR-液相芯片檢測的相對靈敏度

圖3 MPCR液相芯片檢測體系的相對靈敏度實驗（1%）Fig.3 Relative sensitivity of multiplex PCR-liquid array (the simulated GM mixture containing 1% of each event)

圖4 MPCR液相芯片檢測體系的相對靈敏度實驗（0.11%）Fig.4 Relative sensitivity of multiplex PCR-liquid array (the simulated GM mixture containing 0.1% of each event)

圖5 MPCR液相芯片檢測體系的相對靈敏度實驗（0.01%）Fig.5 Relative sensitivity of multiplex PCR-liquid array (the simulated GM mixture containing 0.01% of each event)

以非轉(zhuǎn)基因水稻DNA作為基質(zhì)，摻入不同比例的相應(yīng)品系轉(zhuǎn)基因水稻的DNA（10 ng/μL），配成1%、0.1%和0.01% 3 個百分含量的模擬添加樣品，每個水平各設(shè)3 個平行，且每個品系特異性引物/探針各自設(shè)立陰性和空白對照（以水為模板），進行MPCR-液相芯片檢測。9 個品系的多重PCR-液相芯片檢測結(jié)果見圖3～5（MFI值均為3 次重復(fù)的平均值）。

按照結(jié)果判讀標準，品系KF6、LL62、LL601和T1C-19的相對靈敏度為0.01%，KF8、BT63、KMD1、M12、T2A-1的相對靈敏度達0.1%。由于歐盟及日韓等國轉(zhuǎn)基因標識的閾值都遠高于0.1%，因此，各品系轉(zhuǎn)基因水稻的PCR-液相芯片檢測靈敏度均符合相關(guān)國家和地區(qū)的要求。

3 結(jié) 論

本實驗開展了9 種轉(zhuǎn)基因水稻品系的多重PCR-液相芯片檢測方法研究，與傳統(tǒng)的固態(tài)芯片相比，液相芯片技術(shù)具有高通量、特異靈敏、快速靈活等優(yōu)點，由于微球直徑小，近似液相的反應(yīng)體系有利于提高反應(yīng)速度[16-17]；而且每種探針都使用數(shù)千個微球同時進行雜交檢測，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性都得到了很大提高；檢測通量大，由于多種微球在同一個體系反應(yīng)，理論上可同時檢測100 個靶標基因。液相芯片在食品安全和檢驗檢疫上有很好的應(yīng)用前景[18-20]。

本實驗建立的9 種轉(zhuǎn)基因水稻品系的多重PCR-液相芯片檢測方法，特異性良好，最低檢測限達到0.1%，與傳統(tǒng)低密度固相芯片檢測方法相比，操作更簡便，結(jié)果可信度更高，適用于進出口大米及米制品中轉(zhuǎn)基因成分的高通量檢測，也符合國內(nèi)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的檢測要求。

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Development of Multiplex PCR Coupled with Liquid Bead Array for the Detection of Nine Genetically Modified Rice Events

HUANG Wen-sheng, FU Kai, DENG Ting-ting, LI Fu-wei, LIU Hao, CHEN Ying*
(Chinese Academy of Inspection and Qurantine, Beijing 100123, China)

A multiplex PCR assay coupled with liquid bead array was developed for simultaneous identification of nine genetically modified rice (Oryzae sativa) lines. Based on the junction sequences between host plant genome DNA and the exogenous gene of the GM rice events (BT63, KF6, KF8, M12, KMD1, T1C-19, T2A-1, LL601, and LL62), the eventspecific primers and probes were designed for each event. In addition, in order to reduce the number of PCR reactions, two multiplex PCR systems were adopted and optimized by adjusting the concentration of each primer. Detection specificity was provided by capture probes designed for each GMO rice event which were covalently attached to florescent coding beads. The PCR amplicons were biotin-labeled and directly hybridized with the capture probes on the beads, and then the beads were detected according to protocol of Bio-Rad. The sensitivity of the assay was evaluated and the results indicated that the limit of detection was around 0.1% for 9 events. With improved detection efficiency and accuracy, the detection system complied with the requirements of current regulations in EU, Japan and China for the thresholds for the labeling of GMO, and could be applied in the enforcement of GM regulation in China.

multiplex PCR; liquid bead array; transgenic rice; detection

TS201.6

A

1002-6630（2014）20-0158-06

10.7506/spkx1002-6630-201420032

2013-11-25

國家科技重大專項（2014ZX08012-001）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK083）

黃文勝（1967—），男，研究員，碩士，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：hwscaiq@163.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：chenyingcaiq@163.com