屈慧鴿，宋建強，張 明

（魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025）

超聲波輔助提取葡萄酒泥中酒石酸的工藝優(yōu)化

屈慧鴿，宋建強，張 明

（魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025）

為提高葡萄酒泥中酒石酸的提取量，對其提取工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對酒石酸進行超聲波輔助硫酸提取，并用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明：超聲波對硫酸提取起到一定的強化作用。超聲時間對酒石酸浸提量的影響最大，其次是超聲功率、浸提溫度和浸提時間影響相對較小。最佳提取參數(shù)為料液比1∶3（g/mL）、硫酸溶液濃度0.06 mol/L、超聲功率500 W、超聲時間6 min、浸提溫度75～80 ℃、浸提時間15～20 min。經(jīng)驗證，在該條件 下葡萄酒泥中的酒石酸浸提量達到74 g/kg（酒泥）以上。

超聲波；酒石酸；酒泥；提??；優(yōu)化

酒石酸（2,3-二羥基丁二酸）是一種二元羧酸，主要以鉀鹽的形式存在于多種植物和果實中，也有少量是以游離態(tài)存在，在低溫時對水的溶解度降低，易生成不溶性的鈣鹽[1-2]。酒石酸可以作為食品添加劑，也可以作為制藥行業(yè)的原料，作為抗氧化增效劑、緩凝劑，鞣制劑、螯合劑、藥劑等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、制革、紡織等工業(yè)[3-5]。目前酒石酸的生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法、化學合成法、生物酶法以及從葡萄酒釀造過程中產(chǎn)生的廢棄物中提取等方法[6-9]。

葡萄酒泥，又稱“酒腳”，是葡萄酒釀造過程中沉積于罐底的廢棄物，約占葡萄酒產(chǎn)量的20%。酒泥中含有葡萄微粒、酒石酸晶體、微生物、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)等，其中酒石酸含量占酒泥的10%～15%[10-13]。近年來，隨著葡萄酒的生產(chǎn)和消費的增加，對酒泥的循環(huán)利用成為人們關(guān)注的熱點，但多數(shù)以提取酚類物質(zhì)研究居多，對酒石酸的提取報道相對較少[14-19]。我國關(guān)于從葡萄酒泥或酒渣中提取酒石酸也有少量報道[20-25]，但關(guān)于超聲波輔助硫酸提取工藝優(yōu)化未見報道。

超聲波作為一種天然產(chǎn)物活性成分分離提取的新技術(shù)、新方法，具有方便、高效等特點。因此，本實驗以葡萄酒泥為原料，分別采用硫酸浸提法、超聲波法、超聲波輔助硫酸浸提法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計，采用SPSS 21分析軟件對浸提條件進行工藝優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)提取工藝參數(shù)，為提高酒石酸提取率及降低生產(chǎn)成本提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒泥由本校葡萄酒中試車間提供，為蛇龍珠干紅葡萄酒釀造副產(chǎn)物。

酒石酸（分析純） 天津市廣成化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司；偏釩酸鈉（分析純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；冰乙酸（分析純） 天津博迪化工股份有限公司；硫酸（分析純） 萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；WFJ7200型分光光度計計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器廠；YHG-30×35型遠紅外快速干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 酒石酸提取工藝流程

葡萄酒泥→攪拌均勻→準確稱取→加浸提液→提取→離心→上清液→加入碳酸鈣→攪拌→生成酒石酸鈣→沉降→過濾→濾渣→加鹽酸→酸解→離心→上清液→脫色→濃縮→結(jié)晶→酒石酸晶體

操作要點：準確稱取攪拌均勻的蛇龍珠葡萄酒泥，放入500 mL燒杯中，按照設(shè)計方案加入浸提液進行提取。以酒石酸浸提量作為評價指標，首先通過水提確定料液比，然后通過硫酸加熱浸提法篩選硫酸溶液濃度、浸提溫度和時間，同時通過超聲波提取法篩選超聲功率和時間，最后通過超聲波輔助硫酸浸提法進行正交試驗，先進行超聲波提取，然后再進行加熱酸浸，篩選最佳提取條件。

1.3.2 酒石酸溶液質(zhì)量濃度的檢測

采用偏釩酸鈉比色法[26]。以分析純的酒石酸溶液為標準溶液，配成不同質(zhì)量濃度溶液，準確移取待測液1.00 mL于50 mL的具塞試管中，在待測液中分別移入體積分數(shù)為30%醋酸7.5 mL，質(zhì)量分數(shù)1%的偏釩酸鈉顯色劑10 mL，蓋上瓶塞搖勻，靜置15 min，然后在500 nm波長處測定吸光度，根據(jù)酒石酸溶液的質(zhì)量濃度與吸光度的數(shù)學關(guān)系，繪制標準曲線。最終得到標準曲線的方程為：y=0.120 8x－0.033 8，R2=0.997 5，標準曲線的擬合度良好，可以用于酒石酸質(zhì)量濃度的測定。同理測定待測液，最后通過回歸方程計算出待測液酒石酸質(zhì)量濃度。

1.3.3 酒石酸浸提量的計算

提取結(jié)束后，離心、去殘渣，得到上清液，測量上清液的體積，根據(jù)上述方法檢測上清液的酒石酸質(zhì)量濃度，用以下公式計算酒石酸浸提量。每組實驗重復(fù)3 次，取其平均值。

式中：X為酒石酸浸提量/（g/kg）；c為酒石酸質(zhì)量濃度/（g/L）；V為上清液的體積/L；W為蛇龍珠葡萄酒泥質(zhì)量/g。

1.3.4 設(shè)計方案

1.3.4.1 單因素試驗

準確稱取蛇龍珠葡萄酒泥100 g，加入一定體積的浸提液，分別進行料液比、硫酸溶液濃度、浸提溫度、浸提時間、超聲時間、超聲功率的篩選。

料液比篩選：分別按料液比1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例加水浸提，固定參數(shù)分別為浸提時間20 min，浸提溫度70 ℃。

硫酸溶液濃度篩選：根據(jù)上述試驗確定的最佳料液比1∶3，硫酸溶液濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L和0.10 mol/L，固定參數(shù)分別為浸提時間20 min，浸提溫度70 ℃。

浸提溫度篩選：根據(jù)上述試驗確定的料液比1∶3和硫酸溶液濃度0.06 mol/L，溫度分別設(shè)為60、70、80、90、100 ℃進行篩選，固定參數(shù)為浸提時間20 min。

浸提時間篩選：根據(jù)上述試驗確定的料液比1∶3、硫酸溶液濃度0.06 mol/L和浸提溫度70 ℃，浸提時間分別設(shè)為5、10、15、20、25 min。

超聲功率篩選：料液比為1∶3，超聲時間固定為8 min，超聲功率分別設(shè)為100、200、300、400、500 W。

超聲時間篩選：料液比為1∶3，超聲功率固定為300 W，超聲時間分別設(shè)為2、4、6、8、10 min。

1.3.4.2 超聲波輔助硫酸加熱提取正交設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲時間、浸提溫度和浸提時間4 個因素設(shè)計正交試驗，設(shè)計參數(shù)見表1，3 次重復(fù)，料液比固定為1∶3，硫酸溶液濃度固定為0.06 mol/L。

表1 正交試驗L9（34）因素水平表Table1 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS 21軟件進行實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析，分析實驗數(shù)據(jù)的差異顯著性，并通過該軟件繪制單因素影響酒石酸提取的折線圖以及進行正交試驗的分析。單因素試驗結(jié)果均采用Microsoft Office Excel 2007畫圖直觀描述，用字母表示差異顯著性分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素提取條件的篩選

2.1.1 料液比和硫酸溶液濃度的確定

圖1 不同料液比（A）和硫酸溶液濃度（B）的酒石酸浸提量Fig.1 Effects of material-to-liquid ratio and sulfuric acid concentration on the extraction efficiency of tartaric acid

隨著浸提液比例的增加，浸提液的酒石酸質(zhì)量濃度逐漸降低，但收集的浸提液體積逐漸增加，因此酒石酸浸提量增加。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示不同料液比之間的酒石酸浸提量存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1A）。浸提液比例過小，提取的酒石酸質(zhì)量濃度雖然高，但料液過于黏稠，過濾離心比較困難，而且浸提量較低；浸提液比例過大，雖然浸提量增加，但酒石酸的濃度太低，增加分離濃縮的困難。因此，在后續(xù)實驗中料液比均為1∶3。

關(guān)于酒石酸的酸提取目前廣泛應(yīng)用的主要有鹽酸和硫酸[10]。因為是從葡萄酒泥中提取，酒石酸多以酒石酸鈣、酒石酸氫鉀等酒石酸鹽的形式出現(xiàn)[1]，考慮到硫酸能夠從這些酒石酸鹽中爭奪礦物離子形成沉淀，釋放酒石酸，因此本實驗采用不同濃度的硫酸溶液進行酸提取。由圖1B可知，用硫酸溶液提取的酒石酸浸提量顯著高于用水提?。蛩崛芤簼舛葹? mol/L）。硫酸溶液濃度在0～0.06 mol/L之間，隨著硫酸溶液濃度的增加，酒石酸浸提量增加，且存在顯著性差異；硫酸溶液濃度超過0.06 mol/L時，3 個處理之間的酒石酸浸提量間無顯著性差異。因此，在后續(xù)實驗中，硫酸溶液濃度均采用0.06 mol/L。

2.1.2 浸提溫度和浸提時間的篩選

由圖2A可知，浸提溫度對酒石酸的浸提量有顯著影響。在60～80 ℃之間，隨著溫度的升高，酒石酸浸提量逐漸增加；但溫度超過80 ℃，酒石酸浸提量有所下降，且溫度過高，不僅浪費能源，操作也比較困難。由圖2B可知，浸提時間對酒石酸浸提量具有顯著影響（P＜0.05）。當浸提時間為20 min時，酒石酸浸提量達到最大。在5～20 min之間，隨著浸提時間的延長，酒石酸浸提量顯著增加；浸提時間20 min和25 min之間沒有顯著性差異。

圖2 不同浸提溫度（A）和浸提時間（B）的酒石酸浸提量Fig.2 Effects of steeping temperature and time on the extraction efficiency of tartaric acid

2.1.3 超聲提取條件的篩選

圖3 不同超聲功率（A）和超聲時間（B）的酒石酸浸提量Fig.3 Effects of ultrasonic power and treatment time on the extraction efficiency of tartaric acid time

由圖3A中可知，當超聲功率小于300 W時，隨著超聲功率的增加，酒石酸浸提量逐漸增加，各處理間存在顯著性差異；大于300 W的3 個處理之間無顯著性差異。

由圖3B可知，從2～8 min的4 個處理中，隨著超聲時間的延長，酒石酸浸提量增加，且差異顯著，8 min和10 min的酒石酸浸提量差異不顯著。

通過以上單因素分析發(fā)現(xiàn)，硫酸提取比水提取效果更佳，加熱提取比常溫提取酒石酸浸提量更高，超聲提取比常溫水提取更有利于酒石酸的溶出。因此，為獲得最優(yōu)化的提取工藝，擬采用超聲輔助硫酸加熱提取方法，并通過正交設(shè)計對工藝進行優(yōu)化。

2.2 超聲輔助硫酸加熱提取酒石酸正交試驗

表2 超聲輔助硫酸提取酒石酸的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results for ultrasound-assisted extraction of tartaric acid

表3 超聲輔助硫酸提取酒石酸的方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for ultrasound-assisted extraction of tartaric acid

由表2可知，超聲輔助硫酸加熱提取比任何單一提取的酒石酸浸提量都高，說明超聲波有利于酒石酸的溶出，對酒泥中酒石酸的提取有促進作用。酒石酸浸提量最低的是1號處理，即超聲功率300 W、超聲時間4 min、浸提溫度70 ℃、浸提時間15 min、酒石酸浸提量為65.092 2 g/kg；浸提量最高的是6號處理，即超聲功率500 W、超聲時間6 min、浸提溫度80 ℃、浸提時間15 min、酒石酸浸提量為74.206 6 g/kg。

不同處理間的酒石酸浸提量存在顯著性差異，4 個因素的P值均為0.000，也就是說4 個因素對酒石酸浸提量均有極顯著的影響，極差分析R值為B＞A＞C＞D（表2）；方差分析表中A、B、C、D的均方分別是22.636、78.736、3.755和1.465（表3），也就是說極差分析和方差分析都表明超聲時間對酒石酸的浸提量影響最大，其次是超聲功率、浸提溫度，影響最小的是浸提時間。

2.3 超聲輔助硫酸加熱提取酒石酸工藝優(yōu)化

為了直觀起見，以因素的水平作橫坐標，酒石酸浸提量的平均值作縱坐標，畫出因素與指標的趨勢圖（圖4）。由圖4計算分析后的最佳提取條件是A3B2C3D2，即超聲功率500 W、超聲時間6 min、浸提溫度80 ℃、浸提時間20 min，與直接分析的最優(yōu)提取條件A3B2C2D1（即6號處理）不一致，原因是正交組合簡化試驗處理，在正交試驗L9（34）因素水平表中沒有提取條件組合A3B2C3D2。

圖4 酒石酸浸提量與因素水平關(guān)系圖Fig.4 Correlation analysis between tartaric acid yield and factors or levels

2.4 超聲輔助硫酸加熱提取酒石酸優(yōu)化條件驗證

為確定最佳提取工藝條件，將2 種方法獲得的最優(yōu)提取條件組合同時進行驗證實驗，料液比1∶3、硫酸溶液濃度0.06 mol/L，結(jié)果見表4。

表4 超聲波輔助硫酸提取酒石酸優(yōu)化條件驗證實驗結(jié)果Table4 Validation of optimized conditions for ultrasound-assisted extraction of tartaric acid

由表4可知，在A3B2C3D2的工藝條件下，酒石酸浸提量74.68 g/kg略高于A3B2C2D1條件下的74.21 g/kg，但二者沒有顯著性差異（P＞0.05）。

從提取條件看，2 種方法的超聲波條件是一致的，但浸提溫度和浸提時間不同。由前面的分析結(jié)果看，浸提溫度和浸提時間雖然對酒石酸浸提量有顯著影響，但相對超聲功率和超聲時間來說，影響較小。因此，這2 種方案都是最佳提取工藝條件，即浸提溫度75～80 ℃，浸提時間15～20 min均可，這樣的溫度和時間范圍在實際生產(chǎn)應(yīng)用過程中也便于操作。

2.5 提取方式比較

由表5可知，超聲波輔助硫酸加熱浸提法的酒石酸浸提量最高，比硫酸加熱浸提法高59.40%，比超聲波水提法高80.47%，說明超聲波技術(shù)能夠加強硫酸加熱浸提的效果，這可能是因為超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機械作用破碎了酒泥中的顆粒，有利于酒石酸的溶出，并且加速酒石酸與酒石酸鹽分子的運動，從而提高浸提液中酒石酸質(zhì)量濃度，進而增加酒石酸浸提量。

表5 3 種提取方式的最佳提取參數(shù)及其酒石酸浸提量Table5 Comparison of optimal extraction parameters and tartaric acid yield of three extraction methods

3 結(jié) 論

通過工藝優(yōu)化和驗證實驗，確定超聲波輔助硫酸加熱提取干紅酒泥中酒石酸的最佳工藝為：料液比1∶3、硫酸溶液濃度0.06 mol/L、超聲功率500 W、超聲時間6 min、浸提溫度75～80 ℃、浸提時間15～20 min，酒石酸浸提量可以達到74 g/kg以上。統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，超聲時間對酒石酸浸提量影響最大，其次是超聲功率，浸提溫度和浸提時間影響較小。通過硫酸加熱提取、超聲提取及超聲輔助硫酸加熱提取3 種方式對比發(fā)現(xiàn)，超聲對硫酸加熱提取葡萄酒泥中的酒石酸起到一定的強化作用，能增加酒石酸的浸提量。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Tartaric Acid from Wine Lees

QU Hui-ge, SONG Jian-qiang, ZHANG Ming
(School of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

The ultrasound-assisted extraction of tartaric acid from wine lees using sulfuric acid as the extraction solvent was optimized by single factor and orthogonal array designs to obtain higher tartaric acid yield. Analysis of the experimental data was carried out using SPSS 21 software. The results showed that ultrasound enhanced the extraction of tartaric acid with sulfuric acid. The ultrasonic treatment time had the greatest impact on tartaric acid yield, followed in decreasing order by ultrasonic power, extraction temperature and extraction time. The optimal extraction parameters were determined as 1:3, 0.06 mol/L, 500 W, 6 min, 75-80 ℃, and 15-20 min formaterial-to-liquid ratio, sulfuric acid concentration, ultrasonic treatment power, ultrasonic treatment time, extraction temperature, and extraction duration, respectively. Experiments carried out under these optimal conditions led to an extraction yield of 74 g/kg .

ultrasound; tartaric acid; lees; extraction; optimization

TS261.9

A

1002-6630（2014）20-0083-05

10.7506/spkx1002-6630-201420017

2014-02-08

魯東大學葡萄酒學院建設(shè)發(fā)展基金項目（2012HX027）；張裕集團有限公司橫向基金項目（2012HX020）

屈慧鴿（1968—），女，副教授，碩士，研究方向為葡萄與葡萄酒工程。E-mail：qhge@163.com