劉慧慧，宮向紅， 徐英江，鄒榮婕，李佳蔚，鄧旭修，張秀珍,*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 2 64006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定海米中10種合成色素

劉慧慧1，宮向紅1， 徐英江1，鄒榮婕2，李佳蔚2，鄧旭修2，張秀珍1,*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 2 64006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

建立固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定海米中新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、羅丹明B 10種合成色素的方法。海米中的合成色素用氨化乙醇提取、固相萃取柱凈化，ODS-3 C18柱為分離柱，甲醇和0.02 mol/L乙酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測(cè)器，在360 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，外標(biāo)法定量。10種合成色素在0.2～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積成良好的線性關(guān)系；10種合成色素的檢出限為0.4～1.0 mg/kg。3個(gè)不同加標(biāo)水平的回收率為74.3%～90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.3%。該方法能同時(shí)完成10種合成色素的測(cè)定，可用于海米中合成色素的檢測(cè)分析。

固相萃??；高效液相色譜；海米；合成色素

海米又名蝦米、 干蝦仁，是著 名的海味品，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蛋白質(zhì)含量高達(dá)55%，還含多種維生素。海米中最具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的成分是呈紅色的蝦青素，是迄今 為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化劑。如果海米中的紅色成分褪去，說明蝦青素已經(jīng)被氧化。因此，海米的紅色成為海米新鮮程度的指示劑。

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、色調(diào)多樣、成本低廉等特點(diǎn)。應(yīng)用于食品著色的合成色素叫做食用合成色素，它們自身沒有營(yíng)養(yǎng)且具 有毒性、致瀉性和致癌性[1]。2011年實(shí)施的GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中對(duì)允許在食品中使用的幾種合成食用色素的最大使用量及使用范圍作了明確規(guī)定。海米中禁止添加任何合成色素，但一些不法商販常將劣質(zhì)海米用合成色素進(jìn)行染色，以達(dá)到新鮮海米的顏色。以目前調(diào)查監(jiān)測(cè)情況看，海米中胭脂紅和檸檬黃常有檢出[3]。

現(xiàn)行的食品中合成色素的檢測(cè)方法以飲料、糖、果汁等基質(zhì)比較簡(jiǎn)單的食品居多[4-10]，缺乏海米等干海產(chǎn)品的檢測(cè)方法。海米樣品蛋白質(zhì)含量高且基質(zhì)復(fù)雜，合成色素與蛋白質(zhì)結(jié)合[11-12]，基于簡(jiǎn)單基質(zhì)食品的分析方法不能準(zhǔn)確測(cè)定其中色素的含量。本研究以GB/T 5009.35—2003《食品中合成著色劑的測(cè)定》[13]為基礎(chǔ)，增加了3種紅色系合成色素，以新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、羅丹明B 10種合成色素作為研究對(duì)象，建立了高效液相色譜多組分檢測(cè)方法，旨在提高檢測(cè)效率、填補(bǔ)海米中合成色素檢測(cè)方法的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海米購(gòu)自山東煙臺(tái)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

新紅標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%） 德國(guó)Fluka公司；檸檬黃、日落黃、胭脂紅對(duì)照品 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純）、甲酸、氨水、乙醇、乙酸銨（均為分析純） 德國(guó)Merck公司、實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；聚酰胺固相萃取柱（1 g，6 mL）天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000型高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）戴安（中國(guó)）有限公司；Milli Q Gradient型超純水儀美國(guó)Millipore公司；Labo rota 4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；FA25勻質(zhì)器 德國(guó)Fluko公司；TGL-10C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ASPEC XL4型全自動(dòng)固相萃取儀 法國(guó)Gilson公司；Talboys旋渦混合器美國(guó)Troemner公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸銨（B）；梯度洗脫程序1、2[13]見表1、2；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.0 mL/min。采集10種合成色素在220～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜圖，以確定最佳吸收波長(zhǎng)。

表1 流動(dòng)相梯度1Table 1 Gradient elution program 1 for the separation of the pigments by HPLC

表2 流動(dòng)相梯度2Table 2 Gradient elution program 2 for the separation of the pigments by HPLC

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的新紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，用水配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，取各儲(chǔ)備溶液適量，配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，其中新紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、亮藍(lán)、羅丹明B的質(zhì)量濃度為20 mg/L，赤蘚紅的質(zhì)量濃度為30 mg/L，亮藍(lán)的質(zhì)量濃度為50 mg/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 試劑的配制

提取液1（氨化乙醇）：將無(wú)水乙醇、氨水、水按7∶2∶1（V/V）比例混勻制得；提取液2（氨化乙醇）：將無(wú)水乙醇、氨水、水按6∶4∶0（V/V）比例混勻制得；提取液3：將4 mol/L尿素溶液與甲醇等體積混勻制得。

1.3.4 樣品處理

稱取2.0 g粉碎后的干海米樣品于50 mL離心管中，加入15 mL石油醚，渦動(dòng)3 min，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，肉糜中再加入15 mL石油醚，重復(fù)1次。肉糜經(jīng)上述處理后置于氮吹儀，將殘余的石油醚吹干。分別加入提取液1、2、3，與樣品充分混勻，渦動(dòng)提取3 min，7 000 r/min離心10 min，用脫脂棉過濾上清液，將濾液轉(zhuǎn)移入雞心瓶。對(duì)提取液用量及提取次數(shù)進(jìn)行測(cè)試。將數(shù)次提取的上清液合并入雞心瓶，于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，轉(zhuǎn)入50 mL離心管，用5 mL水洗雞心瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)入離心管，7 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移入25 mL容量瓶中，加入0.6 mL 200 g/L檸檬酸溶液，用水定容至25 mL，混勻，備用。將固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，用10 mL水活化后，加入25 mL提取液，以10 mL 0.05%甲酸水溶液（V/V）淋洗小柱、10 mL 10%氨水甲醇溶液（V/V）洗脫，接洗脫液于10 mL玻璃離心管中，于55 ℃氮吹至近干。用2 mL 20%甲醇水溶液（V/V）溶解殘?jiān)?，過0.45 ?m針孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑

10種合成色素均為水溶性，但由于海米中蛋白質(zhì)含量較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)用水提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素。因此分別采用不同比例的氨化乙醇溶液（提取液1、2）[14-15]、尿素甲醇溶液（提取液3）[16]對(duì)海米樣品進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，提取液1、2、3提取效率分別為95%、87%、84%，提取液1的提取效率最高，且可以省去后續(xù)去蛋白的步驟，簡(jiǎn)化前處理過程。原因是70%～75%的乙醇可以?shī)Z取蛋白質(zhì)的水分，使蛋白質(zhì)相對(duì)過量，相互吸附、凝聚。對(duì)提取液使用量和提取次數(shù)進(jìn)行比較研究，結(jié)果見表3。因此本研究使用提取液1，分別用20、20、10 mL對(duì)樣品進(jìn)行3次提取。

表3 提取液體積和提取次數(shù)對(duì)提取效果影響比較Table 3 Effects of extraction solvent volume and number of extraction cycles on the recoveries 10 synthetic pigments

2.1.2 固相萃取凈化效果

固相萃取凈化是目前大多數(shù)研究者采用的樣品凈化方式，與傳統(tǒng)的液-液萃取法相比可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)[17-23]。國(guó)標(biāo)方法及相關(guān)參照文獻(xiàn)多采用聚酰胺粉吸附法凈化[13,24]，該方法對(duì)上樣及洗脫試劑的pH值要求嚴(yán)格，pH值的波動(dòng)會(huì)影響部分合成色素的吸附及洗脫，最終影響回收率；在淋洗雜質(zhì)時(shí)，含有氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物（如赤蘚紅）會(huì)有很大損失[25]。本研究使用聚酰胺固相萃取小柱凈化，上樣時(shí)只需在提取液中加入少量200 g/L檸檬酸以保證酸性吸附環(huán)境，10種化合物都能得到滿意的回收率。以混合標(biāo)準(zhǔn)中間液過柱的方式測(cè)試固相萃取柱對(duì)各色素成分的回收率，結(jié)果如表4所示。

表4 10種合成色素的回收率Table 4 Recoveries of 10 synthetic pigments

2.1.3 色譜分離條件

圖1 10種合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖（2 mg/kg）Fig.1 Chromatogram of a mixture of 10 synthetic pigment standards (2 mg/kg)

為實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)檢測(cè)，采用250 mm色譜柱進(jìn)行分離。該類物質(zhì)分離常用甲醇（A相）和乙酸銨（B相）為流動(dòng)相，當(dāng)兩者初始體積比為2∶8時(shí)，新紅和檸檬黃出峰時(shí)間過早，且二者重合；將甲醇和乙酸銨溶液初始體積比調(diào)整為1∶9時(shí)，新紅和檸檬黃分離效果好，且不受樣品基質(zhì)干擾。采用梯度洗脫方法1，先使用低有機(jī)相使新紅和檸檬黃分離，22 min后迅速增大甲醇比例，使10種合成色素在40 min內(nèi)分離完全，提高了分離效率。10種合成色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖1。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

采集10種合成色素的吸收光譜圖，多個(gè)化合物具備2個(gè)主 要吸收波段，一個(gè)吸收峰在250 nm左右，另一個(gè)吸收峰在450～600 nm波長(zhǎng)之間，最大吸收波長(zhǎng)如表5所示。選擇波254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，10種合成色素標(biāo)準(zhǔn)品在該波長(zhǎng)處響應(yīng)值較高，但海米樣品在該波長(zhǎng)下雜峰很多，干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定。由于10種化合物的最大吸收波長(zhǎng)不能兼顧，故適當(dāng)犧牲部分化合物的響應(yīng)值，選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在該檢測(cè)波長(zhǎng)下，基線平穩(wěn)，且方法檢出限能夠滿足檢測(cè)要求。

表5 合成色素的最大吸收波長(zhǎng)Table 5 Maximum absorption wavelengths of the pigments

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

表6 色素各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及檢出限Table 6 Calibration equations, linear ranges and detection limits of the pigments

圖2 海米樣品（A）、加標(biāo)海米樣品（B，2 mg/kg）色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank (A) and spiked samples (B, 2 mg/kg) of dried shrimp

在0.2～50 μg/mL范圍內(nèi)，10種合成色素的質(zhì)量濃度與其峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)、線性方程如表6所示。在海米樣品中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按1.3節(jié)方法處理，10種合成色素 檢出限為0.4～1.0 mg/kg。海米樣品、加標(biāo)海米樣品色譜圖如圖2所示。

2.3 回收率、精密度

表7 加標(biāo)回收率和精密度Table 7 Recoveries and precision (RSD) for spiked dried shrimp samples

在空白海米樣品中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，制成3個(gè)水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)水平6個(gè)平行。按1.3節(jié)方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)樣品中10種合成色素含量、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表7。

3 結(jié) 論

本研究建立了海米中10種合成色素的高效液相色譜測(cè)定方法。干海米樣品用氨化乙醇（無(wú)水乙醇∶氨水∶水為7∶2∶1，V/V）提取，經(jīng)聚酰胺固相萃取柱凈化后濃縮測(cè)定。10種合成色素在0.2～50 mg/L范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.4～1.0 mg/kg。在添加水平1～10 mg/kg范圍內(nèi)，回收率在74.3%～90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.3%。實(shí)驗(yàn)表明，本方法靈敏、準(zhǔn)確，能夠滿足海米中合成色素測(cè)定需要。

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Simultaneous Determination of 10 Synthetic Pigments in Dried Shrimps Using Solid-Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIU Hui-hui1, GONG Xiang-hong1, XU Ying-jiang1, ZOU Rong-jie2, LI Jia-wei2, DENG Xu-xiu2, ZHANG Xiu-zhen1,*
(1. Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. Yantai Shanshui Seafood Co. Ltd., Yantai 264006, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultan eous determination of 10 synthetic pigments (new red, lemon yellow, sunset yellow, carminum, azorubin, amaranth, allura red, light blue, erythrosine and rhodamine B) in dried shrimps. Samples were extracted using aminated ethanol and cleaned up on a solid phase extraction column. The chromatographic separation was achieved on an ODS-3 C18column using a mobile phase consisting of me thanol and 0.02 mol/ L ammonium acetate by gradient elution. Ten synthetic pigments were detected by a diode array detector at t he wavelength of 360 nm and quantified by an external standard method. There was a good linear correlation between the concentrations of 10 synthetic pigments and their peak areas in the range of 0.2–50 mg/L. The detection limits of 10 synthetic pigments were 0.4–1.0 mg/kg. The recoveries were in the range from 74.3% to 90.0% and the RSDs were less than 4.3%.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; dried shrimps; synthetic pigments

O657.72

A

1002-6630（2014）04-0170-04

10.7506/spkx1002-6630-201404035

2013-05-28

山東省“水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料”泰山學(xué)者崗位項(xiàng)目；山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012GHY11517）；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012134）

劉慧慧（1981—），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：liuhh615@ 163.com

*通信作者：張秀珍（1964—），女，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：zxz0535501@126.com