胡瑞斌，李 星，王紅楊，王 潔，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

黃瓜過氧化物酶的分離純化及酶學性質

胡瑞斌，李 星，王紅楊，王 潔，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

新鮮的黃瓜經勻漿、抽提、硫酸銨沉淀、CM-Sepharose 離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析后獲得電泳純的過氧化物酶。該酶的比活力、回收率及純化倍數分別為64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。該酶的分子質量為41.15 kD，亞基分子質量為40.21 kD。該酶的最適溫度和最適pH值分別為60 ℃和 6。在25～45 ℃及pH 5～9的范圍內非常的穩(wěn)定。在測定條件下測得該酶的Km值為53.79 mmol/L。硫氰化鉀對該酶活力基本無影響。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、B a2+、Cu2+對該酶都具有激活作用且濃度至50 mmol/L時酶活力分別被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%，然而十二烷基磺酸鈉、抗壞血酸和草酸對該酶有強烈的抑制作用；Zn2+、甲醇、乙醇和異丙醇對該酶有一定的抑制作用。

黃瓜；過氧化物酶；分離純化；性質

過氧化物酶（peroxidase，POD）是由單一肽鏈與卟啉構成的血紅素蛋白。它作為一種氧化還原酶，普遍存在于各種動植物和微生物體內。它具有參與植物體內活性氧的代謝[1]、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）的降解[2]、木質素的合成[3]等生理功能。該酶在食品檢測[4]、酶聯(lián)免疫分析[5]、生物傳感器[6]、污水處理[7]、醫(yī)療[8]等方面具有十分重要的應用價值。當今，該酶的商品化生產主要來源于辣根，但其價格比較昂貴。黃瓜作為一種四季常見的綠色蔬菜，分布于我國各地，具有美容、藥用等價值并含有多種營養(yǎng)成分[9]，且黃瓜廉價易得，黃瓜POD的酶學性質穩(wěn)定、酶活力較高，目前未見黃瓜POD的分離純化的研究報道。本實驗以黃瓜為材料對POD進行分離純化并對其酶學性質進行研究，有利于黃瓜的綜合開發(fā)利用，為該酶提供了新的獲取途徑，為該酶為進一步研究和應用于工業(yè)、環(huán)境及生物醫(yī)學 領域提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

以新鮮的黃瓜為提取過氧化物酶的材料，購買于重慶市北碚區(qū)菜市場。

1.2 試劑

CM-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質量標準品、蛋白質電泳標準品 美國GE Healthcare 公司；考馬斯亮蘭G-250、R-250 美國Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷 香港Farco公司；藍色葡聚糖-2000、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 儀器與設備

AKTA prime plus蛋白質純化系統(tǒng) 美國GE公司；Mill-Q plus超純水儀 美國Millipore公司；精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-2550型分光光度計、蛋白核酸定量儀 日本島津公司；冷凍干燥儀 德國Uni Equip公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 粗酶液的提取

取新鮮黃瓜，用雙蒸水沖洗干凈、擦干，去籽去瓤，稱重剪碎，然后按1∶1（m/V）比例加入4℃預冷的0.05 mol/L磷酸鹽提取緩沖液（pH7.2）勻漿（12 000 r/min、15 s，間隔5 s）后，放置于4 ℃冰箱靜置抽提2 h，4 ℃、12 000 r/min離心60 min，取上清液即得粗酶液。

1.4.2 硫酸銨分級沉淀

向粗酶液中加入硫酸銨粉末至35%飽和度，4 ℃鹽析2 h，12 000 r/min離心35 min收集上清液；加入硫酸銨粉末至70%飽和度，4 ℃鹽析2 h，6 000 r/min離心35 min，收集沉淀；加入0.05 mol/L磷酸鹽提取緩沖液（pH7.2）至沉淀完全溶解，4 ℃用0.05 mol/L pH 7.2磷酸鹽提取緩沖液透析過夜即得初酶液。

1.4.3 CM-Sepharose層析

經0.05 mol/L pH 5的醋酸緩沖液平衡層析柱后，初酶液加樣10 mL，用0～1 mol/L的NaCl溶液（含0.05 mol/L pH 5的醋酸緩沖液）進行線性梯度洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL；測定各管過氧化物酶液的活性和蛋白含量，收集活性較高的酶液透析并冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 Superdex-200層析

經0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液平衡層析柱后，取上述冷凍干燥好的POD用0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液溶解，每次加樣4 mL，用0.05 mol/L pH 5醋酸緩沖液洗脫，流速0.3 mL/min，每管收集3 mL；測定各管過氧化氫酶液的活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，4 ℃雙蒸水透析脫鹽冷凍干燥后，獲得過氧化物酶純品，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 POD活力的測定

按陳貽竹等[10]的方法測定。測定體系為3 mL，含2.775 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、100 μL 4%愈創(chuàng)木酚和100 μL 1% H2O2。加入25 μL酶液后迅速混勻，在25 ℃立即記錄2 min內OD470nm的變化。酶活力單位（U）定義為：在該反應條件下，每分鐘發(fā)生光密度OD470nm改變0.01所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.4.6 POD純度鑒定與分子質量測定[11]

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對該酶進行純度鑒定，分離膠為12%，加樣量10μL。經SDS-PAGE電泳和Superdex-200凝膠過濾層析分別測定該酶亞基分子質量與全酶分子質量。

Superdex-200凝膠過濾層析柱用醋酸緩沖液平衡過夜，流速0.3mL/min，將藍色葡聚糖2000上平衡好的該層析柱，其柱床體積為Vt，測定其外水體積（Vo)；將已知分子質量的標準蛋白質上樣該層析柱，測定每一標準蛋白質的洗脫體積（Ve)并計算各自的有效分配系數（Kav），其計算公式為：Kav=（Ve－Vo)/（Vt－Vo)，然后以標準蛋白質的分子質量的對數lgMr作為X軸，Kav為Y軸，制作蛋白質的標準曲線。按以上方法將黃瓜過氧化物酶上該層析柱并測出其Ve和Kav，根據Kav值查標準曲線并計算即得該酶的分子質量。

1.4.7 蛋白質濃度的測定

分別用紫外分光光度法與考馬斯亮藍染料法（Bradford法）[12]測定該酶的蛋白質濃度。

1.4.8 黃瓜POD的酶學性質測定

1.4.8.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

分別測定在不同溫度（25～85 ℃，間隔為5 ℃)下該酶的活力（最適溫度條件下，測得的酶活力為100%）和分別將酶液放置在不同溫度（25～80 ℃，間隔為10 ℃）下，每隔60 min測定酶活力（25 ℃條件下原酶液的酶活力為100%且測定3 次取平均值），計算該酶的相對酶活力，研究其最適溫度和溫度穩(wěn)定性。

1.4.8.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

分別測定不同pH值（2.2～10.0）下該酶活力以確定最適pH值；分別將酶液放置在不同的pH值（3～9，間隔為1）的緩沖液中，25 ℃每隔60 min測定該酶的活力，二者均以最適條件下測得的酶活力為100%且測定3 次取平均值，計算該酶相對酶活力，研究其最適pH值和pH值穩(wěn)定性。

1.4.8.3 米氏常數（Km）的測定

配制不同濃度的過氧化氫（10～50 mmol/L，間隔為10 mmol/L）作為底物，在測定條件下計算POD的酶活力且測定3次取平均值，用雙倒數作圖法（Lineweaver-Burk法）[13]計算該酶的Km值。

1.4.8.4 部分有機溶劑對POD活性的影響

分別把甲醇、乙醇、異丙醇與醋酸緩沖液（0.05mol/L、pH 5）和酶液混勻（終體積分數分別為10%、20%、30%、40%、50%），4 ℃放置30 min，然后在測定條件下確定該酶的活力（以不加有機溶劑時酶活力為100%且測定3 次取平均值）。

1.4.8.5 部分化合物對POD活性的影響

分別將尿素、草酸、硫氰化鉀（potassium thiocyanate，KSCN）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、抗壞血酸（ascorbic acid，ASA），配成100 mmol/L母液，以一定比例與醋酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5）和酶液混合，使得終濃度分別達到10、20、30、40、50 mmol/L，4 ℃放置30 min，然后在測定條件下確定該酶的活力（以不加化合物時酶活力為100%且測定3 次取平均值）。

1.4.8.6 部分金屬離子對POD活性的影響

分別將部分金屬離子配成100 mmol/L母液，以一定比例與醋酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5）和酶液混合使得終濃度分別達到10、20、30、40、50 mmol/L，4 ℃放置30 min，然后在測定酶活力（以不加金屬離子時的酶活力為100%且測定3 次取平均值）。

2 結果與分析

2.1 黃瓜POD的分離純化

黃瓜POD的粗酶液經CM-Sepharose層析，如圖1所示，有3 個酶活力峰，推測該酶可能有3 個同工酶，收集其酶活力最高的第2個峰中的各管，經Superdex-200層析，如圖2所示，酶活力集中在29～33管，第31管活性最高，收集活性較高的各管，透析冷凍干燥獲得該酶純品，經SDS-PAGE電泳，為單一條帶(圖3)，說明該酶達到了電泳純。該酶的整體分離純化結果如表1所示，可知黃瓜POD純品的純化倍數為61.93，回收率為9.58%，酶比活力達到64177.67U/mg。

圖1 黃瓜POD的CM-Sepharose離子交換層析Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of POD from cucumber

圖2 黃瓜POD的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of POD from cucumber

表1 黃瓜POD的分離純化Table1 Isolation and purification of POD from cucumber

2.2 過氧化物酶的分子質量

經SDS-PAGE后獲得電泳純的單一條帶，測得酶的亞基分子質量為40.21 kD（圖3），經Superdex-200凝膠過濾層析測得該酶的分子質量為41.15 kD，由此可以判定黃瓜過氧化物酶由單一亞基構成。

圖3 黃瓜POD的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified POD from cucumber

2.3 POD的部分酶學性質

2.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下測定黃瓜過氧化物酶的活力如圖4所示，黃瓜過氧化物酶的最適溫度為60 ℃，該酶作用溫度范圍較廣，在30～70 ℃范圍內該酶的活力均保持在80%以上，超出此溫度，酶活力迅速下降，85 ℃時該酶活力仍保留39%。從圖5可知，該酶在25～45 ℃范圍內的熱穩(wěn)定性較好，保溫5 h酶活力均保持在90%以上；55 ℃保溫5 h后酶活力保留49%；高于65 ℃時，酶活力下降迅速；75 ℃保溫1 h后，酶蛋白基本完全失活。

圖4 溫度對黃瓜POD活力的影響Fig.4 Effect of temperatures on the activity of POD from cucumber

圖5 黃瓜POD的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of POD from cucumber

2.3.2 最適作用pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對黃瓜POD活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of POD from cucumber

如圖6所示，黃瓜過氧化物酶的最適pH值為6，在pH 5～7范圍內該酶的活力較高，超出此范圍酶活力迅速下降。從圖7可知，該酶在pH 5～9范圍內穩(wěn)定性較好，保溫5 h其活力均保持在85%以上，在pH 3～4保溫5 h酶活力還保持在38%以上，表明該酶可以耐受較大范圍的pH值，有利于該酶在不同的pH值環(huán)境下發(fā)揮作用。

圖7 黃瓜POD的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of POD from cucumber

2.3.3 米氏常數（Km）的測定

Km值的研究結果如圖8所示，在測定條件下，以過氧化氫（10～50mmol/L）為底物，測定該酶的活力，采用雙倒法作圖求得該酶的Km值為53.79mmol/L。

圖8 雙倒數法測定黃瓜POD的米氏常數Fig.8 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of POD from cucumber

2.3.4 部分有機溶劑對黃瓜POD活性的影響

圖9 甲醇、乙醇、異丙醇對黃瓜POD活力的影響Fig.9 Effects of methanol, ethanol and isopropyl alcohol on the activity of POD from cucumber

如圖9所示，甲醇、乙醇、異丙醇均對該酶有抑制作用，隨著三者濃度不斷升高，酶活力逐漸受到抑制；異丙醇對該酶抑制作用相對較強，甲醇和乙醇對該酶抑制相對較弱，終濃度達50mmol/L時酶活力均保持在75%以上。

2.3.5 不同化合物對黃瓜POD活性的影響

圖10 不同化合物對黃瓜POD活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of POD from cucumber

如圖10所示，在0～50 mmol/L范圍內，隨著各自濃度的逐漸增加，KSCN對該酶活力基本無影響，濃度達到50 mmol/L時，酶活力均在90%以上；尿素對該酶有激活作用，且終濃度至50 mmol/L時使酶活力被激活至112%；草酸對該酶抑制作用較強；SDS和抗壞血酸對該酶抑制作用很強，當其濃度達到10 mmol/L時，該酶的活力為0。

2.3.6 不同金屬離子對黃瓜POD活性的影響

圖11 不同金屬離子對黃瓜POD活力的影響Fig.11 Effects of metal ions on the activity of POD from cucumber

如圖11所示，不同金屬離子及同一金屬離子不同濃度對該酶活力的影響存在一定差異。Zn2+對該酶有一定抑制作用；K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+對該酶有激活作用，且終濃度50mmol/L時該酶的活力分別被激活至127%、113%、128%、139%、199%、348%。

3 討 論

本實驗以黃瓜為材料分離純化獲得電泳純的過氧化物酶，與其他報道相比較，具有以下特點：一是材料四季常見，成本低廉；二是過氧化物酶含有多種同工酶[14]。粗酶液經CM-Sepharose離子交換層析后檢測到3種同工酶，為了獲得單一過氧化物酶純品，選取活力最高的峰作進一步研究，經Superdex-200凝膠過濾層析后仍然得到了較高的回收率（9.58%）、比活力（64177.67U/mg）、純化倍數（61.93），回收率高于棕櫚葉[15]（5.8%）、肖黃櫨[16]（3.3%)和甘薯葉[17]（1.59%）來源的POD，比活力和純化倍數高于來源于椰子[18]（12.8U/mg、9.77倍）和辣根[19]（26805U/mg、29.3倍）。

本實驗所提純的黃瓜POD的作用溫度范圍較廣，在25～85 ℃均有酶活力且在30～70 ℃時該酶的活力均保持在80%以上，其最適溫度為60 ℃，與甘薯葉（60 ℃）[17]來源的相同，高于來源于棕櫚葉（55 ℃）[15]、乳（55 ℃）[20]、豆殼（30 ℃）[21]、女貞果實（40 ℃）[22]、蓮藕（35 ℃）[23]、香草豆（16 ℃)[24]的POD，高于辣根POD (30℃)和經三聚氰酰氯絲固定化的辣根的POD（40 ℃）[25]，表明該酶的最適溫度較高。該酶在25～45 ℃范圍內的熱穩(wěn)定性非常好，保溫5 h酶活力均保持在90%以上，55 ℃保溫5 h后酶活力保留49%且熱穩(wěn)定性高于經三聚氰酰氯絲固定化的辣根POD[25]。該酶的最適pH值為6，和來源于辣根（pH 6）[25]和豆殼（pH 6）[21]的POD相同，低于女貞果實POD（pH 6.5）[22]、高于蓮藕POD（pH 5）[23]、乳POD（pH5～5.5）[20]，遠高于香草豆POD（pH 3.8）[24]。pH值耐受范圍較廣，該酶在pH 5～9范圍內穩(wěn)定性較好，保溫5 h其活力均保持在85%以上，在pH 3和pH 4保溫1 h酶活力還保留50%以上，其穩(wěn)定性高于棕櫚葉[15]和甘薯葉[17]來源的POD。在水果和蔬菜中POD的分子質量一般介于30～54 kD[26]。該酶的亞基分子質量為40.21 kD，與蓮藕（41.5 kD）[23]、紅薯（42.03 kD）[27]、苦瓜(43 kD)[28]來源的POD相近，低于椰子來源的POD同工酶（～47、9 kD）[18]、木瓜POD（69.4 kD）[29]，高于枇杷果肉POD（22.6 kD）[30]，可知該酶的分子結構具有一定的物種差異性。該酶的Km值為53.79 mmol/L，高于豆殼POD（0.41 mmol/L）[21]，遠低于紅甜菜POD（98.61 mmol/L）[31]和甘薯葉POD（291 mmol/L）[17]，可知該酶的親和力相對較高。

甲醇、乙醇、異丙醇對該酶均有抑制作用，與甘薯葉POD[17]所報道的結果一致。KSCN對該酶活力基本無影響，而對甘薯葉POD[17]有非常強烈的抑制作用。SDS、草酸、抗壞血酸對該酶都有顯著的抑制作用。SDS作為一種變性劑能破壞蛋白酶分子中的氫鍵和疏水作用，從而使該酶活力下降為零。草酸對該酶的抑制作用可能是由于維持該酶活性中心的構象進而使該酶的活力不斷下降直至失活?？箟难嶙鳛橐环N自由基清除劑能夠抑制氫過氧化物進而抑制該酶的活性[32]。尿素對該酶有一定的激活作用。不同的金屬離子對POD酶活力的影響也不盡相同，隨著金屬離子濃度的增大，K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+對該酶表現出激活的作用，濃度至50mmol/L時使該酶的活力分別激活至127%、113%、128%、139%、199%、348%，然而其中的Ca2+、Cu2+對辣根來源的POD[19]卻有一定的抑制作用。Zn2+對該酶有一定抑制作用，而對蓮藕POD[23]具有激活作用，說明不同物種來源的POD在性質上存在一定差異，可能是與所處環(huán)境相適應的結果。

[1] BOLWELL G P, WOJTASZEK D. Mechanisms for the generation of reactive oxygen species in plant defence-a broad perspective[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1997, 51: 347-366.

[2] ZHENG X, van HUYSTEE A B. On tyrosine oxidation by cationic POD[J]. Plant Cell Tissue Organ Culture, 1991, 25: 35-44.

[3] CHRISTENSEN J H, BAUW G, WELINDER K G, et al. Purification and characterization of peroxidases correlated with lignification in poplar xylem[J]. Plant Physiology, 1998, 118: 125-135.

[4] 馮東, 李雪梅, 王丙蓮, 等. 用辣根過氧化物酶生物傳感器測定啤酒中的過氧化氫[J]. 釀酒科技, 2011(12): 37-39

[5] 李宗妍, 曹立民, 林洪, 等. 水產品中恩諾沙星殘留的一步法酶聯(lián)免疫檢測研究[J]. 食品科學, 2009, 30(10): 231-235.

[6] 吳萍, 蔡稱心, 張卉, 等. 辣根過氧化物酶-凹土納米復合材料及其制備方法以及基于所述復合材料的生物傳感器: 中國, G01N27/26; G01N21/35[P]. 2011-09-07.

[7] 鄭琦, 李忠銘. 辣根過氧化物酶處理鄰苯二酚廢水的研究[J]. 化學與生物工程, 2007, 24(7): 65-67.

[8] KIM D S, JEEON S E, PARK K C. Oxidation of indole-3-acetic acid by horseradish peroxidase induces apoptosis in G361 human melanoma cells[J]. Cell Signal, 2004, 16: 81-88.

[9] 喬宏宇, 朱芳, 粟長蘭, 等. 黃瓜主要營養(yǎng)品質性狀遺傳分析[J]. 東北農業(yè)大學學報, 2006, 36(3): 290-293.

[10] 陳貽竹, 王以柔. 荔枝果實過氧化物酶(POD)的研究[G]//中國科學院華南植物研究所集刊. 北京: 科學出版社, 1989.

[11] 李建武, 余瑞元. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學出版社, 1994: 207-223.

[12] 李建武, 余瑞元. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學出版社, 1994: 171-176.

[13] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2002: 378-380.

[14] 田國忠, 李懷方, 裘維蕃, 等. 植物過氧化物酶研究進展[J]. 武漢植物學研究, 2001, 19(4): 332-344.

[15] AL-SENAIDY A M, ISMAEL M A. Purification and characterization of membrane-bound peroxidase from date palm leaves (Phoenix dactylifera L.)[J]. Saudi Journal of Biological Sciences, 2011, 18: 293-298.

[16] KUMARA R, SINGH K A, SINGH V K, et al. Biochemical characterization of a peroxidase isolated from Caribbean plant: Euphorbia cotinifolia[J]. Process Biochemistry, 2011, 46: 1350-1357.

[17] 付偉麗, 唐靚婷, 王松, 等. 甘薯葉過氧化物酶的分離純化及其部分性質研究[J]. 食品科學, 2010, 31(7): 223-227.

[18] BALASUBRAMANIAN M, BOOPATHY R. Purification and characterization of peroxidases from liquidendosperm of Cocos nucifera (L.): biotransformation[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2013, 90: 33-42.

[19] MOHAMED S A, ABULNAJA K O, ADS A S, et al. Characterisation of an anionic peroxidase from horseradish cv. Balady[J]. Food Chemistry, 2011, 128: 725-730.

[20] 盧蓉蓉, 許時嬰, 王璋. 乳過氧化物酶的分離純化和酶學性質研究[J].食品科學, 2006, 27(2): 100-104.

[21] 趙楊. 豆殼過氧化物酶的分離純化、酶學性質及固定化研究[D]. 長春: 長春工業(yè)大學, 2011: 34-36.

[22] 王瑧, 廖祥儒, 張建國, 等. 女貞果實過氧化物酶的純化及熱穩(wěn)定性研究[J]. 河北農業(yè)大學學報, 2007, 30(5): 23-27.

[23] 闕瑞琦, 張麗麗, 郭小路, 等. 蓮藕過氧化物酶的分離純化及性質研究[J]. 西南大學學報: 自然科學版, 2007, 29(12): 63-67.

[24] OFELIA M N, WALISZEWSKIA K N, OLIARTA R M, et al. Purification and characterization of cell wall-bound peroxidase from vanilla bean[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(8): 1372-1379.

[25] MOHAMED S A, DARWISH A A, El-SHISHTAWY R M, et al. Immobilization of horseradish peroxidase on activated wool[J]. Process Biochemistry, 2013, 48: 649-655.

[26] VIGYAZOA L V, HAARD N F. Polyphenol oxidase and peroxidase in fruits and vegetables[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1981, 15: 49-127.

[27] ROMPEL A, ALBERS M, NASERI J I, et al. Purification, cloning and characterization of a novel peroxidase isozyme from sweetpotatoes (Ipomoea batatas)[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 2007, 1774: 1422-1430.

[28] FATIMA A, HUSAIN Q. A role of glycosyl moieties in the stabilization of bitter gourd (Momordica charantia) peroxidase[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 41: 56-63.

[29] CHEN L C, CHUNG Y C, CHANG C T, et al. Characterisation of an acidic peroxidase from papaya (Carica papaya L. cv Tainung No. 2) latex and its application in the determination of micromolar hydrogen peroxide in milk[J]. Food Chemistry, 2012, 35(4): 2529-2535.

[30] 林建城, 吳智雄, 彭在勤. 枇杷果肉過氧化物酶的分離純化及其性質研究[J]. 四川農業(yè)大學學報, 2007, 25(4): 419-424.

[31] RUDRAPPA T, LAKSHMANAN V, KAUNAIN R, et al. Purification and characterization of an intracellular peroxidase from genetically transformed roots of red beet (Beta vulgaris L.)[J]. Food Chemistry, 2007, 105: 1312-1320.

[32] POPP J L, KALYANARAMAN B, KIRK T K. Lignin peroxidase oxidation of Mn2+in the presence of veratryl alcohol, malonic or oxalic-acid, and oxygen[J]. Biochemistry, 1990, 29 (46): 10475-10480.

Isolation, Purification and Characterization of Peroxidase from Cucumber

HU Rui-bin, LI Xing, WANG Hong-yang, WANG Jie, TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-Potato Engineering Research Center, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity peroxidase was extracted from fresh cucumber and purified through homogenization, extraction, ammonium sulfate precipitation, CM-Sepharose and Superdex-200 chromatography. The specific activity, recovery and purification fold of the peroxidase were 64 177.67 U/mg, 9.58% and 61.93, respectively. Molecular mass of this purified enzyme was 40.21 kD as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), while native gel filtration confirmed a monomer form of 41.15 kD. Besides, the peroxidase, whose optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6, respectively, was comparatively stable in the temperature range of 25-45 ℃ and pH range of 5-9. The purified peroxidase showed Kmvalue of 53.79 mmol/L under definite conditions. In addition, its activity was scarcely affected by potassium thiocyanate (KSCN). The peroxidase was found to be activated by urea, K+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Ba2+and Cu2+by 12%, 27%, 13%, 28%, 39%, 99% and 248% at 50 mmol/L, respectively. However, the peroxidase activity was significantly inhibited by SDS, ascorbic acid and oxalic acid. Moreover, Zn2+, methanol, ethanol a nd isopropanol caused partial inhibitory effects on the peroxidase.

cucumber; peroxidase; isolati on and purification; characterization

Q946.5

A

1002-6630（2014）11-0168-06

10.7506/spkx1002-6630-201411034

2013-07-09

重慶市科委重點攻關項目（CSTC2011AB1027）

胡瑞斌（1985 —），男，碩士研究生，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：huruibin55@163.com

*通信作者：唐云明（1960 —），男，教授，博士，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn