陳志斌，張洪斌*，胡雪芹，張宇琪

（合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院制藥工程系，安徽 合肥 230009）

響應面法優(yōu)化鏈霉菌A0901產幾丁質酶抑制劑的發(fā)酵條件

陳志斌，張洪斌*，胡雪芹，張宇琪

（合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院制藥工程系，安徽 合肥 230009）

用響應面法優(yōu)化鏈霉菌A0901產幾丁質酶抑制劑的發(fā)酵條件，以提高幾丁質酶抑制劑的產率。利用單因素試驗篩選出最佳碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3。采用兩水平Plackett-Burman法篩選出對產幾丁質酶抑制劑有重要影響的3個因素：可溶性淀粉、ZnCl2和培養(yǎng)溫度，通過最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區(qū)域，最后通過中心組合試驗設計，利用SAS軟件進行回歸分析，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：可溶性淀粉3.76 g/100 mL、NaCl 0.05 g/100 mL、KNO30.1 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 0.05 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.04 g/100 mL、ZnCl20.024 g/100 mL、FeSO4·7H2O 0.001 g/100 mL、初始pH 6、溫度28.54 ℃、轉速250 r/min。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液對幾丁質酶的抑制率達到67.58%，較原發(fā)酵培養(yǎng)基的幾丁質酶抑制率提高36.8%。

幾丁質酶抑制劑；食品保鮮；響應面法；發(fā)酵條件

幾丁質是節(jié)肢動物外骨骼、真菌細胞壁、細胞隔膜及線蟲卵殼的主要組分[1]，幾丁質酶由于其分解幾丁質的作用而在節(jié)肢動物和真菌的生長及發(fā)育過程起重要作用。幾丁質酶抑制劑能特異性地抑制幾丁質酶活性，阻止昆蟲幼蟲和蛹的蛻皮以及真菌子母細胞的分離而起到殺蟲和抗真菌作用[2-3]，因此在食品保鮮和生物殺蟲劑方面具有重要的應用前景。哺乳動物機體不存在幾丁質代謝系統(tǒng)，故以幾丁質酶作為靶標的幾丁質酶抑制劑作為生物殺蟲劑和抗真菌藥物具有對人畜無害和不污染環(huán)境的優(yōu)點，在農業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有巨大潛在價值[4]。因此，以幾丁質酶為靶標的新型生物殺蟲劑、食品保鮮劑，成為國內外關注的新熱點。

長期以來，日本和英國等國一直在進行幾丁質酶抑制化合物的探索性研究，并對已發(fā)現化合物的活性機理、合成路線及相關領域進行了深入研究[5-7]。國內也有少量幾丁質酶抑制化合物的研究報告，但還處于起步階段。至今已報道的幾丁質酶抑制劑主要有：Allosamidin衍生物[8]、Argifin[9-10]、Argadin[11]、Styloguanidines[12]、CI-4[13]、FPS-1[14]、psammaplin A[15]等。但是，由于生產成本高、活性低、不易合成等原因，始終沒有應用于工業(yè)生產。本實驗室發(fā)現一種產幾丁質酶抑制劑的微生物，但發(fā)酵產率不高[16]。本研究將在單因素試驗的基礎上，利用響應面法[17]對幾丁質酶抑制劑產生菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，通過綜合考察和評價獲得最佳的發(fā)酵條件，以提高發(fā)酵產率。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鏈霉菌A0901，系本實驗室篩選、保存。

斜面培養(yǎng)基（g/100 mL）：可溶性淀粉2、蛋白胨1、NaCl 0.05、瓊脂2。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基（g/100 mL）：可溶性淀粉2、NaCl 0.05、K2HPO4·3H2O 0.05、KNO30.1、MgSO4·7H2O 0.05、ZnCl20.05、FeSO4·7H2O 0.001、pH 7.2、121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SPX-250型生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；KQ-500型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；YP5002型電子天平 上海越平科學儀器有限公司；WD800型微波爐 佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；電子萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗篩選最優(yōu)碳源和氮源

分別用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纖維素、幾丁質5種碳源替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，各碳源添加量均為2 g/100 mL，其他條件不變，考察不同碳源對鏈霉菌A0901產幾丁質酶抑制劑的影響；在確定最佳碳源的基礎上，再分別用KNO3、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO44種無機氮源和酵母膏、蛋白胨、脲素3種有機氮源等量替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的KNO3，其他條件不變，測定不同氮源對鏈霉菌A0901產幾丁質酶抑制劑的影響。每組實驗均重復3次。

1.3.2 響應曲面法對發(fā)酵條件優(yōu)化

根據單因素試驗結果，設計Plackett-Burman試驗，對10個因素進行考察，每個因子取高（＋1）和低（－1）2個水平，獲得顯著影響因素。采用Box-Behnken響應面試驗設計[21]確定顯著因子的最優(yōu)水平，以幾丁質酶抑制率為響應值設計三因素三水平共15個試驗組的響應面分析試驗，其中3個為零點，12個為析因點，零點實驗重復3次，以估計誤差。數據用SAS 9.0程序分析確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.3 幾丁質酶活力抑制評價

以N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生成速率測定酶活性大小。50 ℃、1 h產生1 μmol/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位，即1 U[18]。在酶反應體系中加入待測液，測定剩余酶活力，以滅活后的體系和原酶反應體系作為對照，根據酶活力是否下降以及下降的程度來判定抑制性。幾丁質酶抑制物的抑制活性可以用抑制率來計算。

測試組1：500 μL膠體幾丁質加入500 μL酶液和1 000 μL pH6.0磷酸緩沖液，在45 ℃進行酶促反應1 h后沸水浴10 min，后冰浴再加入1500 μL DNS溶液，置沸水浴20 min后冰浴并定容至25 mL，離心收集上清液。

對照組1：500 μL膠體幾丁質加入1 000 μL pH 6.0磷酸緩沖液沸水浴滅活2 min，再加入500 μL酶液沸水浴10 min，冰浴后加入1500 μL DNS溶液，置沸水浴20 min后冰浴，用蒸餾水定容至25 mL，離心收集上清液。

測試組2：500 μL膠體幾丁質加入500 μL酶液和1 000 μL待測發(fā)酵液，在45 ℃進行酶促反應1 h后沸水浴10 min，后冰浴再加入1 500 μL DNS溶液，再置沸水浴20 min后冰浴并定容至25 mL，離心收集上清液。

對照組2：500 μL膠體幾丁質加入1 000 μL 待測發(fā)酵液沸水浴滅活2 min，再加入500 μL酶液沸水浴10 min，冰浴后加入1 500 μL DNS溶液，置沸水浴20 min后冰浴，用蒸餾水定容至25 mL，離心收集上清液。

在540 nm波長下，利用紫外分光光度計測量各組實驗吸光度，測試組1與對照組1的吸光度差值為ΔA1，測試組2與對照組2的吸光度差值為△A2，按以下公式計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗篩選最優(yōu)碳源和氮源

2.1.1 碳源對幾丁質酶抑制劑產量的影響

取不同碳源的發(fā)酵液測定其對幾丁質酶的抑制活性，結果見表1。以可溶性淀粉為碳源時，發(fā)酵液對幾丁質酶的抑制率最高，表明以可溶性淀粉為碳源時幾丁質酶抑制劑的產量最高。

表1 不同碳源條件下A0901鏈霉菌發(fā)酵液對幾丁質酶活性的抑制率測定Table 1 Effects of various carbon sources on the chitinase inhibitory activity by fermented broth

2.1.2 氮源對幾丁質酶抑制劑產量的影響

不同氮源對鏈霉菌A0901產幾丁質酶抑制劑的影響見表2。利用無機氮源時的幾丁質酶抑制劑單位產率最好。

表2 不同氮源條件下A0901鏈霉菌發(fā)酵液對活性菌株發(fā)酵液抑制性的影響Table 2 Effects of various nitrogen sources on the chitinase inhibitory activity by fermented broth

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman design and corresponding experimental results

2.2 Plackett-Burman設計篩選重要影響因素

表4 Plackett-Burman設計的各因素水平及效應評價Table 4 Factor levels and effect estimates for Plackett-Burman design

選用試驗次數N=12的Plackett-Burman試驗設計及結果見表3。采用SAS 9.0[19]進行各因素主效應分析結果見表4，對供試菌株產酶有顯著影響的因素依次為：可溶性淀粉＞培養(yǎng)溫度＞ZnCl2。其中可溶性淀粉對產幾丁質酶抑制劑呈現正效應，ZnCl2和培養(yǎng)溫度則呈現出負效應。這3個顯著因素對產抑制劑的影響可用以下方程表示：Y=45.58＋2.625X1－2.0133X6－2.503X9。方程的決定系數R2=99.91%，表明該回歸方程擬合良好。由顯著因子效應可看出，要提高幾丁質酶抑制劑產量，應適當提高可溶性淀粉質量濃度，降低ZnCl2質量濃度和培養(yǎng)溫度。其他因子影響不大，不做進一步處理。

2.3 最陡爬坡試驗選擇最大響應區(qū)域

響應面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實情況，故應先逼近最大產抑制劑區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據Fractional Factorial Design法篩選出的顯著因子效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計[20]，尋找最大產抑制劑區(qū)。實驗設計及結果如表5所示，最大產抑制劑區(qū)在第5次試驗附近，故以試驗5的條件為響應面試驗因素水平的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Steepest ascent experimental design and corresponding results

2.4 中心組合試驗確定最佳組合

采用Box-Behnken響應面試驗設計[21]確定顯著因子的最優(yōu)水平，以幾丁質酶抑制率為響應值設計三因素三水平共15個試驗組的響應面分析試驗，其中3個為零點，12個為析因點，零點實驗重復3次，以估計誤差，試驗設計方案與結果見表6。每組試驗重復3次，數據均為平均值。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Box-Behnken experimental design and corresponding results

通過SAS 9.0軟件對表6結果進行回歸分析，回歸方程的方差分析結果見表7。該試驗擬合的回歸方程為：

Y1= 67.026 67＋3.177 5X1－3.086 25X2－1.563 75X3－5.329 583X12＋0.135X1X2－4.505X1X3－7.087 083X22＋1.612 5X2X3－4.542 083X32。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance for the regression equation

由表7可知，模型在α=0.01水平上回歸顯著；失擬項P＞0.1，失擬檢驗不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾很小，實驗數據與模型符合情況較好。一次項和平方項對響應值也有顯著的影響。同時，復相關系數的平方（R2）較高，表明方程擬合較好；Y1的變異系數較低，說明實驗操作可信。綜上說明回歸方程給菌株產幾丁質酶抑制劑提供了一個合適的培養(yǎng)基模型。

2.5 響應面分析及最佳培養(yǎng)條件確定

通過回歸方程擬合繪制響應面分析圖形，考察各擬合的響應面曲線的形狀，響應面分析圖形如圖1所示。

圖1 各因素及其相互作用對抑制劑影響的響應面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of various factors and their interaction on the production of chitinase inhibitor

由圖1響應面立體分析圖可直觀地看出X1、X2、X3存在極值點，對Y1進行嶺嵴分析得到極大值所對應的各主要因素X1、X2、X3的編碼值分別為0.490 2、－0.265 7、－0.462 4，即碳源、ZnCl2和發(fā)酵溫度的最佳值分別為3.755 1、0.023 7 g/100 mL、28.54 ℃，此時發(fā)酵液的幾丁質酶抑制劑活性最高，單位抑制活性達到68.576 9%。因而，所得的最佳發(fā)酵條件組合為：可溶性淀粉3.76 g/100 mL、NaCl 0.05 g/100 mL、KNO30.1 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 0.05 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.04 g/100 mL、ZnCl20.024 g/100 mL、FeSO4·7H2O 0.001 g/100 mL、初始pH 6、培養(yǎng)溫度28.54 ℃、轉速250 r/min。

2.6 回歸模型的驗證

以此方法獲得的最佳發(fā)酵條件組合進行發(fā)酵驗證實驗，得到的發(fā)酵液具有幾丁質酶單位抑制活性為67.58%，模型值與實驗值的相對偏差為1.47%，由此可見該模型可以較好地預測發(fā)酵情況，說明此響應面法優(yōu)化獲得的發(fā)酵條件組合是可行、有效的。

3 結 論

采用響應面分析法對幾丁質酶抑制劑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，首先運用Plackett-Burman 法確定出可溶性淀粉、ZnCl2和發(fā)酵溫度為重要影響因素；然后通過最陡爬坡試驗逐步改變三者的水平，逼近最佳響應面區(qū)域；最后采用Box-Behnken試驗設計和SAS 9.0軟件分析確定出主要因素的最優(yōu)條件，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉3.76 g/100 mL、NaCl 0.05 g/100 mL、KNO30.1 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 0.05 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.04 g/100 mL、ZnCl20.024 g/100 mL、FeSO4·7H2O 0.001 g/100 mL、初始pH 6、溫度28.54 ℃、轉速250 r/min。在此條件下發(fā)酵液對幾丁質酶的抑制率達到67.58%，較原發(fā)酵培養(yǎng)基的幾丁質酶抑制率提高36.8%。

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Optimization of Fermentation Conditions for Chitinase Inhibitor Production by Streptomyces sp. A0901 Using Response Surface Analysis

CHEN Zhi-bin, ZHANG Hong-bin*, HU Xue-qin, ZHANG Yu-qi
(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Purpose: To optimize the fermentation conditions for chitinase inhibitor production by Streptomyces sp A0901 by applying response surface analysis. Methods: Firstly, the optimum carbon source and nitrogen source were confi rmed as soluble starch and potassium nitrate respectively based on the results of single-factor experiments. Then, a two-level Plackett-Burman factorial design was used to evaluate the infl uence of seven factors including medium components and fermentation conditions on the production of chitinase inhibitor. Among them, three important factors including soluble starch, ZnCl2and incubation temperature were screened. Further, the steepest ascent path was utilized to determine the optimal region for chitinase inhibitor production．Results: The optimal medium composition and fermentation conditions were determined by central composite design and SAS regression analysis to be 3.76 g of soluble starch, 0.05 g of NaCl, 0.1 g of KNO3, 0.05 g of K2HPO4·3H2O, 0.04 g of MgSO4?7H2O, 0.024 g of ZnCl2, and 0.001 g of FeSO4·7H2O per 100 mL of culture medium with an initial pH of 6 and fermentation at 28.54at a shaker speed of 250 r/min. Conclusions: Under the optimized culture conditions, the inhibition of chitinase by fermented broth of Streptomyces sp. A0901 reached 67.58%, 36.8% higher than before the optimization.

chitinase inhibitor; food preservation; response surface methodology; fermentation conditions

TS201.3

A

1002-6630（2014）03-0139-05

10.7506/spkx1002-6630-201403028

2013-01-05

安徽省國際科技合作項目（08080703017）；國家級大學生創(chuàng)業(yè)訓練項目（201210359077）

陳志斌（1987—），男，碩士研究生，研究方向為生物制藥。E-mail：jimmychen2010@163.com

*通信作者：張洪斌（1970—），男，教授，博士，研究方向為生物制藥與酶工程。E-mail：zhb5678@163.com