張學(xué)梅 許崇安 佘春燕

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤科，遼寧沈陽 110032

惡病質(zhì)是腫瘤常見的并發(fā)癥，近80%的晚期腫瘤患者會出現(xiàn)惡病質(zhì)，近20%的患者直接死于惡病質(zhì)[1]，臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、食欲減退、疲勞、肌肉消耗、臟器功能損害，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及生存期。黃連素作為祖國的傳統(tǒng)中醫(yī)中藥，是毛莨科植物黃連干燥根莖的提取物之一，近年發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用[2]。筆者前期研究證實黃連素能改善癌性惡病質(zhì)的發(fā)生、發(fā)展，現(xiàn)觀察黃連素對小鼠惡病質(zhì)肝腎等重要臟器保護作用，進一步明確其對惡病質(zhì)的改善，并闡明其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小白鼠結(jié)腸癌細胞株CT-26，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心；雌性Balb/c 小白鼠，8周齡，體重18 g 左右，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所；黃連素，購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，國藥準字H21022453；ELISA 試劑盒，購于英國Abcam 公司；原位凋亡檢測試劑盒，購自德國Roche 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將24 只小鼠隨機分成三組，每組8 只，即正常對照組、荷瘤無干預(yù)組、荷瘤黃連素干預(yù)組。

1.2.2 構(gòu)建腫瘤惡病質(zhì)動物模型 建立結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)模型。荷瘤無干預(yù)組和荷瘤黃連素干預(yù)組小鼠腋窩下植入小鼠結(jié)腸腺癌細胞株CT-26（植入量為1×106/0.2 mL）， 植入細胞7 d 后肉眼可見有腫瘤結(jié)節(jié)生成，14 d 的時候小鼠出現(xiàn)瘤塊明顯增大，小鼠消瘦，體重下降且進食量及飲水量下降，活動減少，與正常對照組相比，差異顯著時，進入惡病質(zhì)狀態(tài)，提示構(gòu)建腫瘤惡病質(zhì)小鼠模型成功。

1.2.3 藥物干預(yù) 接種腫瘤細胞第15 天后， 荷瘤黃連素干預(yù)組給予黃連素25 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)15 d；正常對照組、荷瘤無干預(yù)組給予等量生理鹽水灌胃；各組每天給藥1 次，連續(xù)給藥15 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般狀況 觀察小鼠毛色和活動情況。

1.3.2 體重、攝食和飲水量 每兩天用游標尺測定腫瘤的長徑、短徑并稱小鼠體重量1 次，精確到0.1 g，腫瘤體積（V）的估計采用公式V=a×b2/2（a、b 分別為腫瘤的長度與寬度），腫瘤重量（M）的估計采用公式M=V×F（F 為實驗結(jié)束時腫瘤實際重量與體積的比值），利用體質(zhì)量減瘤重來估算去瘤體重量。所有測量均在每天同一時間進行。 每組小鼠同籠喂養(yǎng)，提供同一飼料和飲用水，從接種第1 天開始，記錄每組小鼠攝食總量和飲水總量。

1.3.3 肝、腎功能指標 給藥15 d 后，各組小鼠取全血分離血清，用全自動生化分析儀測定其肝、腎功能。

1.3.4 細胞因子 取接種15 d 后動物血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF）-α 濃度。

1.3.5 肝、腎組織形態(tài) 肝腎組織塊常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下觀察肝腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變并拍照。

1.3.6 肝、腎細胞凋亡指數(shù) 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL） 檢測肝、腎細胞凋亡情況。 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，首先經(jīng)1%焦碳酸二乙酯水溶液處理30 min，以淬滅內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，按試劑盒說明進行操作。 以核棕黃色為陽性，普通光鏡下每片隨機選取5 個400 倍視野，以陽性細胞所占百分比的平均數(shù)為凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察

正常對照組小鼠毛色、活動和攝食及飲水量一直保持正常。 荷瘤無干預(yù)組、荷瘤黃連素干預(yù)組小鼠在接種細胞株7 d 皮下可觸及結(jié)節(jié)，并逐漸長大；至第14 天去瘤體重量較對照組明顯減輕，小鼠活動變得遲緩，毛色變粗糙，攝食量逐漸減少，小鼠全部進入惡病質(zhì)狀態(tài)。 與荷瘤黃連素組小鼠相比，荷瘤無干預(yù)組小鼠活動遲緩及攝食、飲水減少等情況越來越嚴重，毛發(fā)粗糙無光澤，精神狀態(tài)萎靡；而荷瘤黃連素組小鼠經(jīng)治療后活動量和攝食量、飲水量逐漸增加，毛發(fā)逐漸有光澤，精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。 攝食量及飲水量變化情況見圖1、2。

圖1 各組小鼠攝食量變化情況

圖2 各組小鼠飲水量變化情況

2.2 各組小鼠去瘤體重量比較

正常對照組小鼠去瘤體重量為（20.50±1.22）g，荷瘤無干預(yù)組小鼠去瘤體重量為（14.33±1.21）g，荷瘤黃連素干預(yù)組小鼠去瘤體重量為（17.33±1.63）g；荷瘤無干預(yù)組與荷瘤黃連素干預(yù)組較正常對照組去瘤體重量明顯減輕（P < 0.05），荷瘤干預(yù)組小鼠去瘤體重量明顯低于荷瘤黃連素干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。

2.3 各組小鼠肝、腎功能比較

與正常對照組比較，荷瘤無干預(yù)組小鼠白蛋白、膽堿酯酶、肌酐水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而給予黃連素干預(yù)，可改善荷瘤小鼠的肝腎功能，與荷瘤無干預(yù)組比較，上述指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 見表1。

表1 三組小鼠肝、腎功能比較（±s）

表1 三組小鼠肝、腎功能比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P < 0.05；與荷瘤無干預(yù)組比較，#P < 0.05

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2.4 各組小鼠細胞因子水平比較

血清TNF-α 水平在正常對照組為（241.72±28.65）pg/mL，荷瘤無干預(yù)組為（684.12±94.87）pg/mL，荷瘤黃連素干預(yù)組為（336.7±41.94）pg/mL；荷瘤無干預(yù)組與荷瘤黃連素干預(yù)組血清TNF-α 水平較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；荷瘤黃連素干預(yù)組較荷瘤無干預(yù)組TNF-α 水平明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05） 。

2.5 光鏡觀察

2.5.1 肝組織 正常對照組：肝細胞排列緊密，肝小板清晰，細胞核清晰，胞漿均勻染色。 荷瘤無干預(yù)組：肝細胞排列疏松，肝板界限不清晰，細胞腫脹，可見細胞核縮破碎，并伴有炎癥細胞浸潤，細胞呈現(xiàn)空泡樣變，壞死。荷瘤黃連素干預(yù)組：細胞排列相對規(guī)則，細胞仍有部分腫脹，無空泡樣變，大部分細胞核清晰可見，極少細胞核出現(xiàn)固縮及破碎。 見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織光鏡觀察（HE×400）

2.5.2 腎組織 正常對照組：腎小球和腎小管細胞漿及細胞核染色清晰，無病變。荷瘤無干預(yù)組：可見部分腎小球內(nèi)胞質(zhì)外溢，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)腫脹，少量細胞呈現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，偶見炎癥細胞浸潤。 荷瘤黃連素干預(yù)組：腎小球和腎小管細胞染色均勻，細胞核及胞漿著色清晰，偶見上皮細胞腫脹，細胞核少見固縮現(xiàn)象。 見圖4。

2.6 各組小鼠細胞凋亡情況

2.6.1 肝細胞凋亡指數(shù) 正常對照組肝細胞凋亡指數(shù)為（5.46±0.50）%，荷瘤無干預(yù)組為（24.01±2.01）%，荷瘤黃連素干預(yù)組為（19.19±5.79）%，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 見圖5。

圖4 各組小鼠腎組織光鏡觀察（HE×400）

2.6.2 腎細胞凋亡指數(shù) 正常對照組腎細胞凋亡指數(shù)為（2.22±0.59）%，荷瘤無干預(yù)組為（16.20±3.91）%，荷瘤黃連素干預(yù)組為（11.80±1.89）%，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 見圖6。

圖5 各組小鼠肝組織細胞凋亡（HE×400）

圖6 各組小鼠腎組織細胞凋亡（HE×400）

3 討論

惡病質(zhì)是癌癥晚期常見的綜合征，由于長期能量攝入不足，需消耗體內(nèi)各種組織器官的蛋白質(zhì)供能，致使其所含蛋白質(zhì)的量下降，細胞合成DNA 受阻，各種組織和器官生長發(fā)育遲緩，甚至停止，并發(fā)生嚴重萎縮和脂肪變性，造成臟器功能障礙[3]。黃連素是從毛茛科如黃連、黃柏、三顆針等植物根莖中提取的異喹啉類生物堿，具有清火燥濕、瀉火解毒的功效，臨床長期用于解熱、解毒、抗腸道細菌感染[4]。 近年來發(fā)現(xiàn)黃連素還有多種藥理活性，如擴張冠狀血管、降血壓、降血脂、降血糖、抗心律失常、抗腫瘤等[5]。

CT-26 結(jié)腸腺癌惡病質(zhì)動物模型是一個比較理想的模型，它所表現(xiàn)出的炎癥、糖代謝異常、胰島素抵抗、肌肉蛋白及脂肪組織合成減少、分解增加、體質(zhì)量進行性下降、臟器功能損害和全身衰竭等與癌癥惡病質(zhì)患者的表現(xiàn)相似[6]。 本研究應(yīng)用黃連素干預(yù)小鼠CT-26 結(jié)腸腺癌惡病質(zhì)動物模型，提示黃連素能明顯抑制小鼠的體重下降，增加攝食量、飲水量，改善小鼠的一般狀況。

癌性惡病質(zhì)往往伴有多臟器功能損害，終末期常出現(xiàn)多臟器功能障礙[7]。研究表明，多臟器功能損害與惡病質(zhì)誘發(fā)正常器官細胞凋亡有關(guān)[8]。 引起凋亡主要有兩條途徑：細胞外的死亡受體途徑及細胞內(nèi)的線粒體途徑。 前者主要是刺激因素激活細胞內(nèi)P53、Fas、Bcl-2、NF-κB 等基因，由TNF 受體家族介導(dǎo)，使Caspase-8 激活；后者是通過刺激因素影響細胞內(nèi)線粒體的膜電位，導(dǎo)致線粒體內(nèi)細胞色素C 釋放， 胞內(nèi)Ca2+濃度升高，pH 值下降，使Caspase-9 激活。 兩個途徑最后都導(dǎo)致效應(yīng)性Caspase-3 活化，效應(yīng)性Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 激活內(nèi)切核酸酶，使DNA 鏈斷裂，最終細胞結(jié)構(gòu)的全面解體[9]。文獻報道，TNF-α、NF-κB、泛素蛋白酶體參與了癌癥惡病質(zhì)的發(fā)生，且持續(xù)作用貫穿整個疾病過程[10]。 黃連素能抑制NF-κB 活性[11]。本文研究表明，黃連素能明顯減低血清TNF-α 水平，減輕惡病質(zhì)小鼠模型肝腎病理損害程度，減少肝腎組織細胞凋亡，改善惡病質(zhì)小鼠肝腎功能，提高肝臟儲備能力。 其機制可能為黃連素抑制調(diào)控因子NF-κB活化，NF-κB 可進一步調(diào)控凋亡相關(guān)基因，致使肝腎細胞凋亡減少。 NF-κB 抗細胞凋亡是一個涉及多個信號通路的復(fù)雜過程，但其主要方式是通過誘導(dǎo)或上調(diào)抗凋亡基因的表達實現(xiàn)的。這些基因調(diào)節(jié)位點上有NF-κB 的結(jié)合位點，他們的表達產(chǎn)物通過抑制細胞凋亡的死亡受體途徑或線粒體途徑發(fā)揮作用。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡抑制蛋白（IAPs）、Bcl-2 家族、TRAF1、TRAF-2、JNK、c-FLIP、IEX-1L 等都參與NF-κB 激活后的抗細胞凋亡過程[12]。

本研究表明，黃連素口服能改善惡病質(zhì)小鼠狀態(tài)，改善食欲，降低體重丟失，減少肝腎細胞凋亡，保護肝腎功能。 確切分子機制有待進一步研究。

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