鐘慈平，魏 煒，王正虹，邱 宏，胡黎黎，顧萬江，甘 源，唐小琴，李 林*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042；3.西南大學(xué)校醫(yī)院，重慶 400716）

固相萃取-超高效液相色譜法快速檢測(cè)辣椒面中剛果紅

鐘慈平1，魏 煒1，王正虹2，邱 宏2，胡黎黎2，顧萬江2，甘 源2，唐小琴2，李 林3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042；3.西南大學(xué)校醫(yī)院，重慶 400716）

目的：建立測(cè)定辣椒面中剛果紅染料含量的超高效液相色譜方法。方法：采用氨水-乙醇（30：70，V/V）提取劑，超聲加熱輔助提取3 次，合并提取液、濃縮后過HLB固相萃取小柱，以5 mL 1%甲酸-甲醇溶液淋洗、5 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液、氮吹濃縮后定容測(cè)定。使用BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)498 nm；柱溫40 ℃。結(jié)果：回收率為72%～96%，方法檢出限為0.029 0 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～5.97%（n=6），線性方程相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 9。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，適用辣椒面中剛果紅染料含量的測(cè)定。

超高壓液相色譜；辣椒面；剛果紅；含量測(cè)定

剛果紅又名直接大紅4B，由聯(lián)苯胺雙重氮化、與1-氨基萘-4-磺酸偶合而成，屬于典型的直接偶氮染料。分子式為C32H22N6Na2O6S2，相對(duì)分子質(zhì)量為696.67。棕紅色粉末，溶于水呈黃紅色，溶于乙醇呈橙色，幾乎不溶于乙醚[1-2]。剛果紅一般用作醫(yī)學(xué)臨床診斷、生物染色劑及化學(xué)指示劑等[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)其具有一定致癌性，歐盟等國(guó)家嚴(yán)格禁止其在食品中使用[5-8]。近年來食品安全事件頻發(fā)，尤其是非法添加物甚至是有毒物質(zhì)不斷被檢出。染料由于著色力強(qiáng)、堅(jiān)牢度大且價(jià)格低廉而被一些不法商家大量使用，“蘇丹紅事件”以及國(guó)內(nèi)的“火鍋羅丹明事件”等層出不窮。GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定食品中禁止添加工業(yè)染料[9]，由于蘇丹紅、羅丹明B、堿性橙這幾類染料的檢測(cè)方法已比較成熟，商販可能開始轉(zhuǎn)移使用其他紅色類染料，其中，剛果紅價(jià)格便宜、著色效果優(yōu)秀、使用比較廣泛，因此有必要建立一種靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)食品中非法添加剛果紅染料的方法。

關(guān)于紡織物和印染廢水中剛果紅的檢測(cè)已有研究[10-13]，但基于食品基質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。目前，食品中工業(yè)染料的檢測(cè)方法主要是液相色譜法[14-16]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-19]，其中普通高效液相色譜法研究較多，但耗時(shí)較長(zhǎng)、精確度不高；而超高效液相色譜具有快速高效、高分離度等特點(diǎn)，目前逐漸用于食品藥品等分析檢測(cè)中[20]。由于食品基質(zhì)復(fù)雜，樣品的凈化富集必不可少，一般采用固相萃取、液-液萃取、凝膠凈化等方法[21-22]。本研究采用氨化乙醇作為提取劑，超聲加熱輔助提取，以HLB固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，建立了對(duì)染料具有較大吸附的辣椒面中剛果紅超高效液相色譜檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒面購自某市大型超市、批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等；剛果紅（純度95%） 中國(guó)上海試劑三廠；甲醇、乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；氨水、無水乙醇、乙酸銨、甲酸（均為分析純） 重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTMUPLC液相色譜儀（配有AcquityTM型TUV檢測(cè)器）、Acquity UPLC BEH C18柱、Oasis HLB萃取柱（6 mL/2 00 mg）、Sep-pak NH2氨基柱（3 mL/500 mg）、MCX萃取柱（6 mL/200 mg）、WAX萃取柱（6 mL/200 mg） 美國(guó)Waters公司；AR1140電子天平 北京賽多利斯儀器公司；KQ-500E超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器公司；Milli-Q超純水設(shè)備 美國(guó)Millipore公司；Multifugc X1R高速離心機(jī) 安徽科大創(chuàng)新股份公司；TU-1950紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；N-EVAP-45氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；HWS28型恒溫水浴鍋 上海一恒科技公司；Cleanert PA聚酰胺萃取柱（100～200目，1 g/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司；PSA萃取柱（1 000 mg/6 mL） 杭州富?？萍挤?wù)公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPL CBEHC18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)498 nm；進(jìn)樣量5.0 μL。以保留時(shí)間結(jié)合光譜掃描圖定性，采用外標(biāo)法定量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取剛果紅標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用50%乙腈溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。采用逐級(jí)稀釋方法，用空白基質(zhì)提取液和體積分?jǐn)?shù)10%的乙腈溶液將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1、2、4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品系列。

1.3.3 超聲提取

稱取2.000 0 g左右辣椒面于50 mL離心管中，加入20 mL石油醚除脂2 次，揮干石油醚后加入氨化乙醇提取液25 mL，振蕩提取15 min，65 ℃條件下超聲處理20～30 min，以4 000 r/min離心8 min，收集上清液于100 mL燒杯中，殘?jiān)^續(xù)以15 mL提取液重復(fù)提取2 次，合并上清液。80 ℃水浴蒸發(fā)至10 mL以下（不得揮干），用50%乙腈溶液（含1%甲酸）溶解并轉(zhuǎn)移至比色管中定容。

1.3.4 樣品凈化

取1.0 mL樣品提取液，過HLB固相萃取柱（事先以6 mL甲醇、6 mL純水活化，6 mL pH 4的檸檬酸平衡），以5 mL pH 4的檸檬酸淋洗1 次、5 mL 1%甲酸-甲醇溶液淋洗、水洗至中性，以5 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45 ℃條件下氮?dú)獯抵两?，?0%乙腈溶液稀釋定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后采用超高效液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)剛果紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10 μg/mL）進(jìn)行紫外-可見掃描（圖1），發(fā)現(xiàn)剛果紅在236 nm和498 nm波長(zhǎng)附近具有較大吸收峰，由于在236 nm附近有較強(qiáng)的雜質(zhì)干擾，故可選擇498 nm作為定量檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 剛果紅的光譜掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of Congo red

2.1.2 柱溫和流動(dòng)相的選擇

表1 流動(dòng)相洗脫程序Table1 Gradient elution program

比較了不同流動(dòng)相的分離效果，當(dāng)甲醇-乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，分離度沒有乙腈-乙酸銨好，且存在基線干擾，因此選擇乙腈-乙酸銨作為流動(dòng)相。由于超高壓液相色譜儀出峰比較快且干擾物出峰時(shí)間比較接近，需采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，經(jīng)優(yōu)化的梯度洗脫條件如表1所示。將混標(biāo)溶液（剛果紅與赤蘚紅、誘惑紅、胭脂紅、紅2G、日落黃、檸檬黃、直接紅Ⅱ）按照表1的梯度條件在40 ℃柱溫條件下進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物與干擾物質(zhì)全部在4 min內(nèi)出峰，各峰之間分離度高且峰形良好（圖2），在目標(biāo)物出峰位置沒有干擾峰，表明色譜條件能滿足分析要求。

圖2 8種合成色素和直接紅染料超高效液相色譜圖（4 μg/mL）Fig.2 UPLC chromatogram of mixed standard solution of eight synthetic colorants and Direct Red dye (4 μg/mL)

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 提取劑的選擇

圖3 氨水體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣椒面中剛果紅提取回收率的影響Fig.3 Effect of ammonia concentration (by volume) on the recovery of Congo red from chili powder

以不含剛果紅染料辣椒面作為基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較甲醇、無水乙醇、乙腈、丙酮、50%甲醇溶液、50%乙腈溶液、正己烷-乙腈（1：1）等提取劑的超聲提取效果，提取濃縮液于15 000 r/min高速離心后過濾膜，進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，提取回收率都很低，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求。參考 文獻(xiàn)[23-25]，選擇氨化甲醇、氨化乙醇和氨化乙腈（氨水體積分?jǐn)?shù)均為20%）作為提取劑，發(fā)現(xiàn)回收率均有所提高，其中氨化乙醇的回收率最高。因此考察了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇氨水提取2次的回收率（圖3）。

由圖3可知，隨著氨化乙醇中氨水體積分?jǐn)?shù)的增加，回收率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%～40%時(shí)，回收率達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定。但進(jìn)一步提高氨水體積分?jǐn)?shù)，剛果紅回收率有所下降?？紤]提取試劑成本和對(duì)環(huán)境的污染等因素，最終采用30%氨水的乙醇作為提取劑。

2.2.2 超聲溫度的選擇

采用氨水體積分?jǐn)?shù)為30%的氨化乙醇對(duì)加標(biāo)辣椒面超聲提取2次，比較了常溫（25～30℃）和65℃條件下的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲溫度提高至65℃時(shí)，回收率達(dá)到90.62%，明顯高于同條件下常溫超聲提取的效果（圖4）。

圖4 超聲溫度對(duì)辣椒面中剛果紅回收率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the recovery of Congo red from chili powder

2.2.3 超聲提取次數(shù)的選擇

在65℃條件下，氨水體積分?jǐn)?shù)為30%的氨化乙醇作為提取劑，考察不同超聲次數(shù)對(duì)辣椒面中剛果紅染料的提取效果。

圖5 超聲提取次數(shù)對(duì)辣椒面中提取剛果紅回收率的影響Fig.5 Effect of number of extraction cycles on the recovery of Congo red from chili powder

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，剛果紅回收率呈上升趨勢(shì)，提取3～5次時(shí)，回收率達(dá)到90%以上且提高幅度較小，趨于穩(wěn)定。因此，可選擇3次超聲提取辣椒面中的剛果紅。

2.3 凈化條件的選擇

由于食品樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，提取液高速離心后直接進(jìn)樣分析，雜峰較多，基質(zhì)成分干擾很大且很容易堵塞液相分離柱。因此參考文獻(xiàn)[26-28]并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件分別選取了Agela聚酰胺柱、HLB柱、WAX柱、MCX柱、Sep-pak NH2氨基柱、PSA柱作為萃取柱，考察凈化效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸性條件下剛果紅在HLB柱、Sep-pak NH2氨基柱和PSA柱上吸附很好，堿性條件下可順利洗脫，回收率都達(dá)到96%以上。但HLB柱對(duì)雜質(zhì)的洗脫能力最強(qiáng)，因此可選擇HLB小柱對(duì)樣品進(jìn)行萃取。

圖6 不同萃取柱對(duì)辣椒面中提取剛果紅回收率的影響Fig.6 Effect of different extraction columns on the recovery of Congo red from chili powder

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢出限

按照2.1.2節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、其相應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸得到回歸方程：Y=34 213.07X＋46.31，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，剛果紅在0.2～4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。儀器檢出限為0.006 μg/mL，該方法的檢出限為0.029 0 mg/kg。

2.5 方法的回收率、精密度和重復(fù)性

表2 剛果紅在辣椒面中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table2 Average recoveries and RSD of Congo red from spiked chili samples (n=6)

選取不含剛果紅的辣椒粉作為基質(zhì)，對(duì)剛果紅染料進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。每一添加水平平行測(cè)定6次，取平均值，考察方法的回收率和精密度，同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在10 mg/kg和20 mg/kg添加水平條件下剛果紅的回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足實(shí)驗(yàn)求。而加標(biāo)質(zhì)量濃度為2 g/kg時(shí)，回收率只有72%，相對(duì)較低，主要原因可能是由于辣椒基質(zhì)對(duì)樣品的吸附造成的。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)采自某市大型超市、批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等的20份辣椒面樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢測(cè)出剛果紅染料。

3 結(jié) 論

本研究以對(duì)染料具有較強(qiáng)吸附作用的辣椒面作為基質(zhì)，采用氨水體積分?jǐn)?shù)為30%的氨化乙醇提取劑，65℃超聲提取3次，HLB萃取小柱凈化樣品。采用超高效液相色譜測(cè)定，選擇498 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，柱溫40℃，方法的回收率達(dá)到72%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～5.97%（n=6），檢出限為0.029 0 mg/kg，線性方程相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 9。剛果紅在4 min內(nèi)出峰并與雜質(zhì)峰分離度良好。該法具有較高精確度和準(zhǔn)確度，檢出限低，能滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出辣椒面中的剛果紅染料。同時(shí)也可用于食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為國(guó)家制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Determination of Congo Red in Chili Powder by Solid Phase Extraction Coupled with Ultra-High Performance Liquid Chromatography

ZHONG Ci-ping1, WEI Wei1, WANG Zheng-hong2, QIU Hong2, HU Li-li2, GU Wan-jiang2, GAN Yuan2, TANG Xiao-qin2, LI Lin3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Chongqing Center for Disease Control and Prevention, Chongqing 400042, China; 3. Hospital of Southwest University, Chongqing 400716, China)

Objective: To establish a method for determining Congo red in chili powder by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC). Methods: Samples were extracted with a mixture of ammonia and ethanol (30:70, V/V). The extraction process was aided by ultrasonic treatment and repeated three times. The combined extract was concentrated and then clean-up on an HLB solid-phase extraction cartridge by washing with 5 mL of 1% formic acid in methanol and elution with 5 mL of 10% ammonia in methanol. The collected eluate was concentrated under a stream of nitrogen prior to analysis. The chromatographic separation was achieved within 4 min on a BEH C18column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) by gradient elution using acetonitrile as mobile phase A and 10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase B at a fl ow rate of 0.4 mL/min. The detection wavelength was set at 498 nm and the column temperature was maintained at 40 ℃. Results: Average recoveries of Congo red from chili samples spiked three concentration levels ranged from 72% to 96% with relative standard deviation of 2.16%–5.97% (n = 6). The detection limit of the proposed method was 0.029 0 mg/kg, and the correlation coeffi cient for the calibration curve was 0.999 9. Conclusion: This method is simple, rapid, accurate, sensitive and suitable for detecting Congo red dye in chili powder.

ultra-high performance liquid chromatography (UPLC); chili powder; Congo red; quantitative determination

TQ613.12

A

1002-6630（2014）10-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201410037

2013-07-10

鐘慈平（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：zcp772@163.com

*通信作者：李林（1957—），男，教授，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生。E-mail：lilinlqc@163.com