劉 閃，劉良忠，李小娜，劉 亮，王 燕

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢市水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 43002 3）

白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝優(yōu)化

劉 閃，劉良忠*，李小娜，劉 亮，王 燕

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢市水產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 43002 3）

為減少淡水魚加工過程中副產(chǎn) 物對(duì)環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)、提高淡水魚的附加值，對(duì)白鰱魚骨制備膠原多肽螯合鈣的工藝進(jìn)行研究。以白鰱魚骨 和氯化鈣為原料，在一定條件下制備膠原多肽螯合鈣，考察溫度、魚骨膠原多肽與氯化鈣的質(zhì)量比、時(shí)間、pH值對(duì)螯合率和螯合 物中鈣含量的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)膠原多肽螯合鈣工藝進(jìn)行四因子二次 正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，得到魚骨膠原多肽螯合鈣的最佳工藝參數(shù)為溫 度42 ℃、時(shí)間38 min、魚骨膠原多肽與氯化 鈣的質(zhì)量比2.1：1、pH 6.8，此條件下的螯合率和 螯合物中的鈣含量分別為80.4% 和12.1%。對(duì)螯合鈣進(jìn)行氨基 酸組成成分分析，其總氨基酸含量為61.03%，且具備典型的膠原蛋白氨基酸組成特征。紅外光譜掃描和電鏡掃描觀察表明：鈣離子與膠原多肽發(fā)生了螯合反應(yīng)，結(jié)合方式有離子結(jié)合、配位結(jié)合和吸附作用。

魚骨；膠原多肽；螯合鈣

我國漁業(yè)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球養(yǎng)殖產(chǎn)量的70%，2010年中國水產(chǎn)總量達(dá)到5 373萬 t，其中淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為2 346.53萬 t，草魚產(chǎn)量422.22萬 t，位居首位；其次是白鰱魚，產(chǎn)量為360.75萬 t[1]。隨著我國漁業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品加工也越來越引起人們的重視。白鰱魚為我國典型的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，占水產(chǎn)養(yǎng)殖總量的25%左右，主要用于淡水魚糜的加工。加工過程產(chǎn)生大量的廢棄物，約占魚體質(zhì)量的40%左右，其中廢棄魚骨在廢棄物總量中所占比例近50%。魚骨中含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及膠原成分是開發(fā)魚骨鈣產(chǎn)品及魚類膠原低聚肽的良好資源[2-3]。陸劍鋒等[4]以斑點(diǎn)叉尾鮰魚魚骨制備膠原 多肽，并與氯化鈣進(jìn)行螯合，制備膠原多肽螯合鈣。余海霞等[5]以鮟鱇魚骨為原料，利用酶法超微鈣粉技術(shù)制備魚骨超微鈣粉，并對(duì)其進(jìn)行了生物利用率的研究。Morimura等[6]利用酶解法從魚骨中提取膠原蛋白，其具有降血壓的功能，可以添加到食品中。Jung等[7]以鱈魚骨為原料制備的魚骨磷酸肽，并與鈣進(jìn)行螯合，得到的螯合鈣進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，證明其可以防止小鼠體內(nèi)礦物質(zhì)的流失。

近年來，我國居民鈣營養(yǎng)不足的問題受到了廣泛的重視。營養(yǎng)調(diào)查表明，我國居民鈣攝取量普遍偏低，人均每日鈣攝入量僅為鈣的推薦供給量的50%左右[8]。目前市場上補(bǔ)鈣產(chǎn)品主要為無機(jī)鈣制劑和有機(jī)鈣制劑2種。補(bǔ)鈣效果與鈣的吸收和其在骨骼中的沉積效果有關(guān)。高品質(zhì)的補(bǔ)鈣劑須達(dá)到吸收率高、易在骨骼中沉積且無毒副作用的要求。研究表明，膠原占骨質(zhì)總量的80%，膠原的流失是骨病發(fā)生的主要原因之一[9-10]。只有補(bǔ)鈣的同時(shí)補(bǔ)充足夠的膠原，才能保證骨骼成分的合理比例，防治骨類疾病的發(fā)生[11]。因此，以魚骨為原料，研究開發(fā)膠原蛋白肽螯合鈣具有重要的意義。

本研究以酶解法制備的白鰱魚骨膠原多肽液，向其加入鈣源，制備白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣。通過單因素試驗(yàn)與四因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定最佳的工藝參數(shù)。利用高效液相對(duì)螯合鈣進(jìn)行氨基酸組分分析，通過紅外光譜和電鏡掃描，確定膠原多肽與鈣發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，有新物質(zhì)產(chǎn)生，為新型補(bǔ)鈣產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈣（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市百世化工有限公司；鹽酸（分析純） 中國平煤神馬集團(tuán)開封東大化工有限公司試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉、三乙醇胺（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鉻黑T（分析純） 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；鹽酸羥胺（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；7200型分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AR214O Adventure電子分析天平 美國Ohaus公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀美國Thermo Nicolet公司；S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 魚骨膠原多肽酶解液的制備

取清洗干凈、經(jīng)80 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干8 h的魚骨30 g，磨粉后過60 目篩，用5.9%鹽酸浸泡、攪拌、脫鈣（30 min，43 ℃，料液比1：5.5（mg/mL），脫鈣率達(dá)到80%以上）；堿性蛋白酶（20 AU/g）酶解（料液比1：30（mg/mL），溫度50 ℃，時(shí)間4 h，用1.0mol/L氫氧化鈉、1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 9.0，加酶量5%（m/m）），100 ℃滅酶5 min，4 000 r/min離心10 min后，調(diào)節(jié)pH值至6，40 ℃條件下活性炭吸附40 min（添加量3%（m/m）），采用0.22 μm濾膜過濾（0.1 MPa，常溫）后濃縮（45 ℃，0.1 MPa），制得魚骨膠原多肽酶解液。

1.3.2 魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝流程

酶解液→調(diào)整螯合條件→加入適量氯化鈣→乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到90%以上，靜置沉淀3 h）→微濾→真空冷凍干燥（-50 ℃，4.0 Pa，72 h）

1.3.3 檢測方法

鈣含量的測定：采用EDTA絡(luò)合滴定法[12]。按式（1）計(jì)算螯合物中鈣含量：

螯合率的測定：移取5 mL待測液，加入無水乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到90%），靜置3 h，微濾；將濾液再次濃縮后進(jìn)行乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到95%以上）靜置3 h，微濾，取濾液測定游離鈣含量，按式（2）計(jì)算螯合率。

可溶性多肽的測定：Folin-酚法[13]。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)單一因素對(duì)膠原螯合鈣工藝參數(shù)的相關(guān)研究[15-19]，在水系中合成膠原多肽螯合物時(shí)，影響合成反應(yīng)的主要因素有：pH值、反應(yīng)時(shí)間、溫度、質(zhì)量比等。因此，試驗(yàn)以pH值、反應(yīng)時(shí)間、溫度、質(zhì)量比為考察因素。

1.3.4.1 最佳質(zhì)量比的確定

多肽與鈣離子的結(jié)合有一定的配位比，設(shè)定pH 7.0、時(shí)間50 min、溫度50 ℃條件下，選擇酶解液中蛋白質(zhì)與氯化鈣的質(zhì)量比為0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標(biāo)確定最佳的質(zhì)量比。

1.3.4.2 最佳pH值的確定

設(shè)定質(zhì)量比為2：1、時(shí)間50 min、溫度50 ℃，選擇pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標(biāo)確定最佳的pH值。

1.3.4.3 最佳螯合時(shí)間的確定

設(shè)定質(zhì)量比為2：1、pH值7.0、溫度50 ℃，選擇時(shí)間為20、30、40、50、60、70 min，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標(biāo)確定最佳的螯合時(shí)間。

1.3.4.4 最佳螯合溫度的確定

設(shè)定質(zhì)量比為2：1、pH值7.0、時(shí)間50 min，選擇溫度為30、40、50、60、70 ℃，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標(biāo)確定最佳的螯合溫度。

1.3.5 四因子（1/2實(shí)施）二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化螯合工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以螯合率和螯合物中鈣離子含量為指標(biāo)，采用四因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，取3次平行測量的平均值，利用SPSS軟件進(jìn)行回歸分析。試驗(yàn)的因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Factors and levels used in quadratic orthogonal rotational combination design

1.3.6 螯合物中氨基酸組成成分分析

用高效液相色譜儀測定樣品氨基酸組成。取適量的膠原多肽螯合鈣凍 干粉樣品，用6 mol/L HCl在110 ℃水解24 h，過濾、蒸干，再溶解并定容至50 mL容量瓶，作為測定氨基酸組成用的分析樣。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

取適量的膠原多肽螯合鈣凍干粉樣品，在4 000～400 cm-1波段內(nèi)用傅里葉紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描，分辨率0.1 cm-1。

1.3.8 掃描電鏡分析

將適量的膠原多肽螯合鈣凍干粉樣品均勻涂于樣盤雙面膠上，噴金鍍膜處理。處理好的樣品放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在4 000 倍下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件：高壓15 kV；束流6.9×10-2mA；工作距離16.2 mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)與氯化鈣質(zhì)量比

圖1 酶解液中蛋白質(zhì)與氯化鈣的質(zhì)量比對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.1 Effect of protein to CaCl2mass ratio on chelating capacity and chelated calcium content

由圖1可以看出，酶解液中蛋白質(zhì)與氯化鈣的質(zhì)量比對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量有非常顯著的影響。配位體質(zhì)量過高，肽的利用率下降，配位體過低，螯合物不穩(wěn)定[20]。在質(zhì)量比為0.5：1時(shí)，盡管螯合物中鈣含量比較高，但螯合率比較低，很多鈣離子未參與螯合反應(yīng)。隨著質(zhì)量比的不斷增加，螯合率不斷升高，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到2：1后，變化的幅度逐漸縮小，說明配體質(zhì)量比的增大有利于螯合反應(yīng)的充分進(jìn)行。當(dāng)配體的質(zhì)量比進(jìn)一步增加，螯合物中鈣含量降低，說明有 多余的膠原多肽未被螯合，降低了膠原多肽的利用率。因此，選擇質(zhì)量比為2：1較為合適。這一結(jié)果與單體氨基酸螯合物有些差別，可能是由于膠原蛋白水解物作為配體，其組成成分復(fù)雜，既有氨基酸，又有不同分子質(zhì)量的多肽。因此，該配體與鈣的螯合反應(yīng)不像氨基酸那樣單一。

2.2 pH值

圖2 pH值對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.2 Effect of pH on chelating capacity and chelated calcium content

由圖2可知，pH值對(duì)于螯合率和螯合物中鈣含量有較大影響，酸性條件和堿性條件下螯合率相對(duì)較低。其原因可能是當(dāng)溶液中H＋大量存在時(shí)，H＋將會(huì)與Ca2＋爭奪供電子基團(tuán)，羧基配位能力較弱，不利于螯合物的形成[21]；而在堿性條件下，OH-與供電子基團(tuán)爭奪鈣離子而形成羥橋化物，從而生成了氫氧化鈣沉淀[22]，經(jīng)無水乙醇洗后被除去。在中性條件下，配體受H＋和OH-影響較小，提供了充分的供電子基團(tuán)，從而有利于鈣通過配位鍵形成螯合物[23]。洪惠[24]和趙妍焉[25]等分別利用魚骨和豬骨制備膠原多肽螯合鈣，研究pH值對(duì)螯合效果的影響，得出螯合反應(yīng)的最佳pH值分別為8.0和7.9。本實(shí)驗(yàn)在pH值為8.0時(shí)，螯合率與螯合物中鈣的含 量最高。

2.3 螯合時(shí)間

由圖3可知，螯合時(shí)間在30～50 min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，螯合率和螯合物中鈣含量不斷升高，隨后螯合率和螯合物中鈣含量不斷下降，可能原因是在合適的溫度下，螯合時(shí)間過短，反應(yīng)不徹底，有大量的游離鈣和配體；螯合時(shí)間過長，已經(jīng)螯合的鈣發(fā)生了解離，可能由于羰基與氨基發(fā)生了羰氨反應(yīng)，減少了可以與鈣發(fā)生螯合的羰基和氨基的數(shù)量。由此，可以進(jìn)一步推理出，鈣的螯合反應(yīng)較羰氨反應(yīng)更迅速，但與鈣螯合的鍵的強(qiáng)度較羰氨反應(yīng)的鍵的強(qiáng)度峰弱，但是這一機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。該試驗(yàn)中，螯合時(shí)間在50 min時(shí)螯合率和螯合物中鈣含量達(dá)到最大值。

圖3 時(shí)間對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.3 Effect of chelating time on chelating capacity and chelated calcium content

2.4 螯合溫度

圖4 溫度對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.4 Effect of chelating temperature on chelating capacity and chelated calcium content

由圖4可知，螯合率和螯合物中鈣含量在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著溫度的升高，螯合率和螯合物中鈣含量逐漸降低。反應(yīng)溫度過高，可能會(huì)使氨基酸或小肽發(fā)生羰氨反應(yīng)，與鈣離子形成競爭；反應(yīng)溫度過低則螯合反應(yīng)速度過慢而且造成螯合效率降低[26]。由于氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為吸熱反應(yīng)，因此適當(dāng)?shù)奶岣叻磻?yīng)溫度有利于提高多肽的溶解度使螯合反應(yīng)順利進(jìn)行，選擇溫度為40 ℃時(shí)螯合效果最佳。

2.5 四因子（1/2實(shí)施）二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)

由表2可知，螯合率和螯合物中鈣含量2個(gè)參考指標(biāo)受質(zhì)量比影響較大，兩者具有負(fù)相關(guān)性。膠原多肽與氯化鈣質(zhì)量比增大，螯合率升高，螯合物中鈣含量降低；反之，螯合率下降，螯合物中鈣含量升高，且通過螯合率可以計(jì)算出螯合物中的鈣含量。因此，選擇其中1個(gè)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析。利用SPSS對(duì)螯合率進(jìn)行回歸分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，結(jié)果見表3、4。

以螯合率為響應(yīng)值，進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程為Y=73.796＋12.261X1-0.684X2＋1.045X3-0.753X4-5.813-1.695-2.225-2.137，R值為9.458， P＜0.01，表明回歸方程有顯著性意義。在回歸方程的基礎(chǔ)上進(jìn)行規(guī)劃求解，得到螯合率為80.5%，此時(shí)的質(zhì)量比、時(shí)間、溫度、pH值分別為2.1：1、38 min、42 ℃、6.8。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，螯合率達(dá)到80.4%，螯合物中的鈣含量為12.1%，說明該模型可以很好的預(yù)測結(jié)果。

表2 四因子二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table2 The experiment results of quadratic orthogonal rotational combination design

表3 回歸系數(shù)估計(jì)值Table3 Estimated coefficients of the regression model

表4 方差分析結(jié)果Table4 ANOVA

2.6 螯合物的氨基酸組成分析

表5 螯合鈣中氨基酸組分Table5 Amino acid composition of calcium-chelating collagen polypeptide

在優(yōu)化條件下制備的螯合鈣經(jīng)酸解進(jìn)行氨基酸組成成分分析。由表5可知，螯合鈣中的主要氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸等，而胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸含量相對(duì)較少。因此其符合典型的膠原蛋白氨基酸組成特征[27-28]。

2.7 膠原多肽及其螯合鈣的 紅外光譜分析

圖5 膠原多肽與膠原多肽螯合鈣紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of collagen peptide and its chelate with calcium

由圖5可以看出，膠原多肽與鈣螯合后圖譜發(fā)生了移動(dòng)。屬于蛋白質(zhì)紅外光譜的酰胺A和酰胺B的譜帶分別位于3 344 cm-1和3 074 cm-1波段處，主要由N—H的伸縮振動(dòng)所致；一般認(rèn)為，3 080 cm-1波段附近是多肽（—CONH-）的特征吸收峰，而在2 970.63 cm-1波段出現(xiàn)了吸收峰，說明了膠原多肽具有多肽特征。而由C=O的伸縮振動(dòng)引起的1 654 cm-1波段處的吸收峰屬于酰胺Ⅰ帶；1 558 cm-1波段處的吸收峰屬于酰胺Ⅱ帶，是由N—H面內(nèi)彎曲和部分的C—N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；1 447 cm-1波段處的吸收峰屬于膠原多肽氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，應(yīng)是—COO-的吸收峰。由于膠原多肽的甘氨酸和特征氨基酸（羥脯氨酸和脯氨酸）含量高，且形成獨(dú)特的Gly-Pro-Hyp序列，使得多肽在1 200～1 400 cm-1波段范圍內(nèi)具有其他蛋白質(zhì)所沒有的紅外光譜特征，1 068.04 cm-1和1 388.83 cm-1波段處的吸收峰歸屬于酰胺Ⅲ帶，是C—N伸縮和N—H彎曲振動(dòng)的偶合，它與酰胺II帶不同，主要以C—N伸縮振動(dòng)為主；膠原多肽的特征氨基酸Hyp的特征吸收峰在1 121.33 cm-1和836.71 cm-1波段處也被表征出[26,28]。

對(duì)比膠原多肽的紅外光譜圖，可以發(fā)現(xiàn)膠原多肽與鈣進(jìn)行螯合后，整個(gè)波形發(fā)生了移動(dòng)。在特征區(qū)，氨基的伸縮振動(dòng)吸收峰（N—H）由3 344 cm-1移到3 299 cm-1，說明膠原多肽中的N—H鍵發(fā)生了化學(xué)變化；在指紋區(qū)，C=O的吸收峰移動(dòng)到 了1 6 61 cm-1，—COO-的吸收峰移至1 407 cm-1，說明氨基上的氮原子與羧基上的氧原子均參與了螯合反應(yīng)，也說明反應(yīng)產(chǎn)物確實(shí)為膠原多肽螯合鈣，膠 原多肽與鈣發(fā)生了配位、離子結(jié)合反應(yīng)。

2.8 膠原多肽及其螯合鈣的電鏡掃 描結(jié)果

圖6 膠原多肽（A）及其螯合鈣（B）的電鏡掃描圖Fig.6 Scanning electron micrographs of collagen peptide and its chelate with calcium

由圖6可以看到，膠原多肽螯合鈣表面鑲嵌著不少的白色晶體，應(yīng)該是吸附在膠原多肽粉上面的鈣晶體。付文雯[29]對(duì)牛骨膠原多肽螯合鈣的電鏡照片顯示膠原多 肽表面“鑲嵌”著白色晶體，膠原多肽與鈣之間有一定的吸附作用。因此，膠原多肽與鈣之間的螯合反應(yīng)除了有離子結(jié)合、配位結(jié)合，還有一定的吸附作用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)首次選用白鰱魚骨制備膠原多肽，并與鈣進(jìn)行螯合，得到既能夠補(bǔ)充人體膠原，又能補(bǔ)充鈣的膠原多肽螯合鈣。通過單因素和四因子二次正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到膠原多肽液和鈣離子的最佳螯合條件為：溫度42 ℃、pH 6.8、時(shí)間38 min，膠原多肽與鈣的配比為2.1：1，此條件下的鈣螯合率為80.4%，螯合物中鈣含量為12.1%。此結(jié)果略低于楊燊[30]和陸劍鋒[4]等分別對(duì)南海低值魚蛋白和斑點(diǎn)叉尾鮰魚骨膠原多肽與鈣進(jìn)行螯合（螯合率分別為81.75%和83.53%），明顯高于黃薇等[31]利用復(fù)合酶解制備鱈魚皮復(fù)合肽（其螯合率為58.85%），也高于彭巧云等[32]利用膠原多肽制備螯合鈣（其螯合物中鈣含量為7.77%）。產(chǎn)生這種差異的原因，可能是由于原料、制備的多肽氨基酸組分、分子質(zhì)量不同，導(dǎo)致最佳螯合條件不同，使其螯合率有高低。

對(duì)螯合物進(jìn)行氨基酸分析，具有典型的膠原蛋白氨基酸組 成特征。紅外光譜分析表明膠原多肽的氨基和羧基都與鈣發(fā)生了配位、離子結(jié)合，膠原多肽與鈣進(jìn)行了成功的螯合。電鏡掃描分析表明部分鈣離子吸附在膠原多肽上，說明膠原多肽與鈣離子也有一定的吸附作用。

膠原多肽螯合鈣由骨膠原蛋白水解肽與鈣離子螯合而成，在螯合過程中膠原蛋白肽除了與鈣離子發(fā)生螯合作用外，同時(shí)還存 在其他一些反應(yīng)，如羰氨反應(yīng)等，發(fā)生羰氨會(huì)減少與鈣離子螯合的基團(tuán)。多肽螯合鈣的功能性、毒性和不同分子質(zhì)量的吸收性能以及不同條件下不同分子質(zhì)量螯合鈣的溶解性和穩(wěn)定性，可作為下一步研究的重點(diǎn)。

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Optimization of the Preparation of Calcium-Chelating Polypeptides from Silver Carp Bone Collagen

LIU Shan, LIU Liang-zhong*, LI Xiao-na, LIU Liang, WANG Yan
(Aquatic Products Engineering and Technology Research Center of Wuhan City, College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

In order to achieve value-added utilization of byproducts of freshwater fish processing and simultaneously reduce environmental pollution and resource waste, silver carp bone was used as the raw material to prepare calcium-chelating collagen polypeptides. Under given conditions, calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature, mass ratio between bone collagen polypeptides and calcium chloride (P/C), time and pH. On the basis of the results of single-factor experiments, the four reaction parameters were optimized by a fourfactor quadratic orthogonal rotational combination design to be 42 ℃, 38 min, a P/C ratio of 2.1:1 and pH 6.8, yielding a calcium binding capacity of 80.4% and a chelated calcium content of 12.1%. Amino acid composition analysis showed that the calcium-chelating collagen polypeptides obtained contained 61.03% amino acids in total and had typical amino acid composition characteristics. Infrared spectroscopic analysis and scanning electron microscopy observation confirmed the chelating reaction between calcium ion and collagen polypeptides by ionic bonding, coordination or adsorption.

fish bone; collagen peptide; chelated calcium

TS201.2

A

1002-6630（2014）10-0076-06

10.7506/spkx1002-6630-201410014

2013-10-02

湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目（C2010040）；武漢輕工大學(xué)研究生教育創(chuàng)新基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2012cx001）

劉閃（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾沦Y源開發(fā)與利用。E-mail：16582919llf@sina.com

*通信作者：劉良忠（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾沦Y源開發(fā)與利用。E-mail：liu2022888@163.com