王 冰，陳 洋，李寶麗，朱宇軒，唐翠娥，黃艷春，張 締，劉 睿,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070；2.武漢市蜂產(chǎn)品質量控制工程技術研究中心，武漢 430070）

蜂膠乙酸乙酯提取物 的反相高效液相色譜-質譜分離鑒定

王 冰1,2，陳 洋1，李寶麗1，朱宇軒1,2，唐翠娥1,2，黃艷春1，張 締1，劉 睿1,2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070；2.武漢市蜂產(chǎn)品質量控制工程技術研究中心，武漢 430070）

以河南南陽蜂膠為原料，采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴射串聯(lián)質譜對蜂膠乙酸乙酯提取物進行分離鑒定。以10種黃酮對照品為分析對象建立分析方法，10種黃酮對照品的線性相關系數(shù)為0.998 2～0.999 9，加標回收率為93.40%～103.69%，且精密度、穩(wěn)定性和加標回收率的相對標準偏差均小于5%。采用該法對蜂膠乙酸乙酯提取物進行分析，河南蜂膠中可能含有槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、白楊素、松屬素、高良姜素、短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯、短葉松素-3-丙酸酯和短葉松素-3-丁酸酯11種黃酮類化合物以及對甲氧基肉桂酸肉桂酯和咖啡酸苯乙酯2種酚酸及其酯類化合物。

蜂膠；反相高效液相色譜-質譜；黃酮；酚酸及其酯類

蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹干采集的樹膠，混入蜜蜂的上額腺、蜂蠟而形成的芳香性樹脂狀固體物質[1]。蜂膠含有豐富的多酚化合物，報道較多的酚酸及其酯類物質有咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、亞桂皮乙酸、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯，黃酮有5-甲氧基短葉松素、短葉松素、山奈酚、芹菜素、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因、高良姜素、柚木柯因[2-6]，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、提高機體免疫功能、保護肝臟以及抗氧化等多種生理功能[7-11]，這些功能與蜂膠的成分密切相關[1]。

目前大多數(shù)研究皆關注蜂膠醇提物或水提物[12-15]，但是近期國內(nèi)外的研究表明蜂膠乙酸乙酯提取物具有與醇提物不同的生物活性成分和功效。如中國蜂膠乙酸乙酯提取物對霉菌的抑制效果高于乙醇提取物的抑制效果[16]，土耳其蜂膠乙酸乙酯提取物對變形鏈球菌的生長和黏附的抑制率皆好于70%乙醇提取物[17]。在蜂膠對人體中性白細胞彈性蛋白酶的抑制作用的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)：蜂膠的丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、40%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、96%乙醇等溶劑提取物中，蜂膠乙酸乙酯提取物的半最大效應濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）值最小，抑制效果最好[18]。但是導致蜂膠乙酸乙酯提取物與醇提物活性差異的原因并不是很清楚，文獻報道也少見。

我國是蜂膠生產(chǎn)大國，河南省是我國的主要蜂膠產(chǎn)地和集散地，蜂膠產(chǎn)量超過全國蜂膠產(chǎn)量的30%，對其活性成分進行分析鑒定，對于蜂膠的精深加工具有重要的指導意義。用于分析天然產(chǎn)物及其相關產(chǎn)品中活性成分的方法有很多，比較常用的是高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[19-20]。本研究旨在建立蜂膠乙酸乙酯提取物的反相高效液相色譜-質譜聯(lián)用（reverse phase-HPLC-mass spectrometry，RP-HPLCMS）分析方法，對蜂膠活性成分進行鑒定，為進一步研究蜂膠乙酸乙酯提取物的組成成分與生物活性之間的關系提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠樣品由河南南陽蜂農(nóng)提供，樣品采集后置于－18 ℃冰箱保存。

石油醚、乙酸乙酯（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；對照品：楊梅黃酮、桑色素、芹菜素、蘆丁、槲皮素、松屬素、山奈酚、異鼠李素、白楊素、高良姜素（純度≥98%） 蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Thermo-Fisher公司；甲酸（色譜純） 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

KQ-100DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；e2695高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Empower色譜工作站） 美國Water公司；1100 Series LC-MSD Trap-SL質譜儀 美國Agilent公司；0.22 μm微孔濾膜 大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙酸乙酯提取蜂膠中活性成分

稱取80 g河南南陽蜂膠原料，粉碎后用石油醚除去蜂蠟，按料液比1∶11（g/mL）用乙酸乙酯超聲萃取3次，萃取條件：超聲波功率100 W、溫度30 ℃、時間30 min。3次提取液合并離心后，取上清液，于40 ℃真空濃縮，冷凍干燥成粉末。

1.3.2 供試品溶液的制備

精確稱取河南南陽蜂膠乙酸乙酯提取物10.00 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，超聲處理5 min，靜置至室溫后，用甲醇定容，搖勻，取適量溶液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.3.3 對照品標準溶液的制備

將10種黃酮對照品配成一系列質量濃度范圍為0.5～5 mg/mL的對照品標準溶液。

將對照品標準溶液各吸取150 ?L配成混和對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為儲備液，4 ℃保存。

1.3.4 對照品及樣品RP-HPLC分析條件優(yōu)化

比較甲醇-水、乙腈-水以及不同甲酸含量的乙腈-甲酸溶液作為流動相的等度洗脫以及各種梯度洗脫效果；在梯度洗脫條件下比較流速分別為0.4、0.7、1 mL/min和1.2 mL/min的洗脫效果，確定色譜條件。

色譜柱：T h e r m o H y p e r s i l G O L D C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-0.3%甲酸；梯度洗脫：0～10 min，15%～20%；20～35 min，30%～35%；65～75 min，50%～95%；80～85 min，15%～15%；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；二極管陣列（diode array detector，DAD）檢測器；檢測波長280 nm。

1.3.5 南陽蜂膠乙酸乙酯提取物的質譜條件

電噴霧離子化（electronspray ionization，ESI）離子源；負離子模式檢測；離子源噴射電壓3.5 kV；毛細管加熱溫度350 ℃；噴霧電壓40 psi；霧化氣（N2）流速80 kPa；干燥氣（N2）流速10L/ min；碰撞氣體為氦氣；全離子掃描方式；掃描范圍m/z 50～1 000。

1.3.6 南陽蜂膠乙酸乙酯提取物的分析鑒定

將南陽蜂膠乙酸乙酯提取物中待測物質的紫外圖譜、分子離子、碎片離子峰質荷比與對照品和相關文獻進行比較，進行定性分析與鑒定。

2 結果與分析

2.1 RP-HPLC-DAD色譜條件的建立與優(yōu)化

RP-HPLC-DAD流動相一般選用甲醇、乙腈和水。用甲醇-水作流動相，多酚類化合物出峰時間較晚，且不能獲得很好的分離，色 譜峰拖尾嚴重。用乙腈-水作流動相時能有效改善出峰時間晚的問題，色譜峰分布較均勻，但仍然有拖尾現(xiàn)象，這是由于酚羥基的解離，使其在固定相表面有雙重保留機制。在流動相中加入酸性抑制劑（如甲酸、乙酸）可使酚羥基的解離被抑制，在RP-HPLC條件下，成為中性疏水締合物，使分離效果和峰形得到改善?？紤]到色譜柱的耐酸范圍，選定乙腈-0.3%甲酸溶液體系作為流動相，在梯度洗脫條件下，發(fā)現(xiàn)當流動相流速為0.4 mL/min和0.7 mL/min時，色譜峰出峰時間晚的現(xiàn)象仍然不能得到有效改善；而當流動相流速為1 mL/min和1.2 mL/min時，皆能得到理想的分離效果，考慮到延長色譜柱壽命、降低泵運作時的壓力，最終選擇流動相的洗脫流速為1 mL/min，通過優(yōu)化得出最優(yōu)RP-HPLC-DAD的分析條件為：流動相乙腈-0.3%甲酸；梯度洗脫：0～10 min，15%～20%；20～35 min，30%～35%；65～75 min，50%～95%；80～85 min，15%～15%；流速1 mL/min。在最佳色譜分離條件下，10種黃酮對照品達到基線分離，結果見圖1。

圖1 對照品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of flavonoid reference standards

2.2 線性關系考察

將10種黃酮對照品的混和儲備液分別稀釋0、2、4、8、16、32倍，配成一系列對照品溶液，采用上述優(yōu)化好的色譜條件進樣10 ?L分析，以標準樣品質量濃度為橫坐標（x）、相應的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程；以信噪比（RSN）為3確定各黃酮類化合物的檢出限。結果見表1。10種黃酮對照品在各自的線形范圍內(nèi)相關系數(shù)滿足實驗要求。

表1 10種黃酮對照品的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限Table1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and detection limits for 10 flavonoids

2.3 精密度

使用優(yōu)化后的色譜條件檢測，10種混和黃酮對照品溶液平行連續(xù)測定6次，計算相對標準偏差，以考察精密度。10種黃酮對照品的保留時間和峰面積積分的相對標準偏差均小于2%，精密度良好。結果見表2。

表2 10種黃酮對照品的精密度Table2 Precision of the method

2.4 穩(wěn)定性

將10種黃酮混和對照品溶液分別放置0、4、8、12、18、24 h后進樣考察。在24 h內(nèi)測定其峰面積變化，結果見表3。10種黃酮類物質的保留時間和峰面積積分的相對標準偏差均小于5%，說明穩(wěn)定性良好。

表3 10種黃酮對照品的穩(wěn)定性Table3 Stability of the method

2.5 加標回收率

取10 mg蜂膠乙酸乙酯提取物定容至5 mL容量瓶，配制2份平行樣品，1份單獨進樣，1份取1 mL并加入0.2 mL混合對照品溶液進樣。每份樣品平行測定3次，計算回收率和相對標準偏差。結果見表4。黃酮的回收率為93.40%～103.69%，且相對標準偏差均小于2%，滿足蜂膠樣品中黃酮類化合物分析的要求。

表4 7種黃酮對照品的回收率Table4 Recovery of the method for 7 flavonoids

2.6 南陽蜂膠乙酸乙酯提取物的分析與鑒定

根據(jù)優(yōu)化好的色譜條件并結合給定的ESI-MS-MS條件進樣分析河南南陽蜂膠乙酸乙酯提取物樣品，其分離鑒定的結果如圖2、3所示。

圖2 南陽蜂膠乙酸乙酯提取物的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract of Nanyang propolis

圖3 南陽蜂膠乙酸乙酯提取物的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of ethyl acetate extract of Nanyang propolis

分析色譜峰對應的紫外圖譜、分子離子、碎片離子峰質荷比，通過與對照品相比較并結合參考相關文獻[4,21-22]發(fā)現(xiàn)：南陽蜂膠乙酸乙酯提取物樣品中含有選定的10種黃酮對照品中的7種黃酮，分別是槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、白楊素、松屬素和高良姜素，此外，樣品中可能還含有另外6種其他物質，結果見表5。

表5 蜂膠乙酸乙酯提取物中色譜峰的紫外光譜和碎片離子鑒定參數(shù)Table5 UV absorption wavelengths and ion fragment parameters of propolis chromatogram peaks

另外，比較圖1、2可知，對照品溶液和南陽蜂膠乙酸乙酯提取物樣品中的成分基本達到基線分離，結合方法學的考察結果可知，所建立的分析方法可以用于蜂膠乙酸乙酯提取物中成分的分離；通過與對照品圖譜比較，發(fā)現(xiàn)南陽蜂膠乙酸乙酯提取物中不含有蘆丁、楊梅黃酮、桑色素，而且槲皮素、異鼠李素含量很少。而GB/T 19427—2003《蜂膠中蘆丁、楊梅酮、槲皮素等含量的測定》規(guī)定蘆丁、楊梅酮、槲皮素、莰菲醇（山奈酚）、芹菜素、松屬素、柯因（白楊素）、高良姜素這8種黃酮是蜂膠中主要存在的黃酮，本研究結果與該規(guī)定的差異性還需進一步分析，加以確認。但是在中國蜂膠中黃酮類化合物的部分研究中也沒有檢測到蘆丁、楊梅酮、桑色素[3-4,6,23-25]。

由表5可知，除槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、白楊素、松屬素和高良姜素7種黃酮外，在南陽蜂膠乙酸乙酯提取物中可能還含有了短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯、短葉松素-3-丙酸酯、短葉松素-3-丁酸酯4種黃酮類化合物以及對甲氧基肉桂酸肉桂酯、咖啡酸苯乙酯2種酚酸酯類化合物。

3 結 論

本研究建立了分析蜂膠乙酸乙酯提取物的RP-HPLC條件：Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-0.3%甲酸；梯度洗脫：0～10 min，15%～20%；20～35 min，30%～35%；65～75 min，50%～95%；80～85 min，15%～15%；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；DAD檢測器；檢測波長280 nm。所建立的RP-HPLC-DAD分析方法使蜂膠乙酸乙酯提取物中大多數(shù)組分得到了基線分離，10種對照品黃酮的線性相關系數(shù)為0.998 2～0.999 9，加標回收率為93.40%～103.69%，且精密度、穩(wěn)定性和加標回收率的RSD值均小于5%，方法具有準確、穩(wěn)定、重復性好、加樣回收率高等特點，可以用來分析蜂膠乙酸乙酯提取物中的黃酮及酚酸類化合物。

通過RP-HPLC-DAD-ESI-MS-MS分析并與對照品及文獻對比，南陽蜂膠中可能存在有11種黃酮類化合物，分別為槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、白楊素、松屬素、高良姜素、短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯、短葉松素-3-丙酸酯和短葉松素-3-丁酸酯，而沒有檢測到蘆丁和楊梅黃酮和桑色素；存在2種酚酸酯類化合物，分別為對甲氧基肉桂酸肉桂酯和咖啡酸苯乙酯。

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Separation and Identification of Ethyl Acetate Extract of Propolis by Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

WANG Bing1,2, CHEN Yang1, LI Bao-li1, ZHU Yu-xuan1,2, TANG Cui-e1,2, HUANG Yan-chun1, ZHANG Di1, LIU Rui1,2,*
(1. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministery of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Wuhan Research Center on Quality Control Engineering of Bee Products, Wuhan 430070, China)

The purpose of this study is to separate and identify ethyl acetate extract of propoils from Nanyang, central China’s Henan province by reverse phase-high performance liquid chromatography-diode array detector compled with electro spracy ionization-tandem mass spectrometry (RP-HPLC-DAD-ESI-MS-MS). A method for detecting 10 flavonoid reference standards was established using RP-HPLC-DAD. The linear correlation coefficients for the ten flavonoids were 0.998 2–0.999 9 and the recoveries were 93.40%–103.69%. The RSDs of precision, stability, and spiked recovery were all less than 5%. The ethyl acetate extract of Henan propolis was analysed by RP-HPLC-DAD-ESI-MS-MS. Totally 11 flavonoids were identified including quercetin, apigenin, kaempferol, isorhamnetin, chrysin, pinocembrin, galangin, pinobanksin, pinobanksin-3-O-acetate, pinobanksin-3-O-propionate, pinobanksin-3-O-butyrate and two phenolic acids and their esters.

propolis; reverse phase-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (RP-HPLC-MS); flavonoids; phenolic acids and esters

TS201.2

A

1002-6630（2014）02-0186-05

10.7506/spkx1002-6630-201402035

2013-07-19

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（2013PY100）；武漢市工程技術研究中心項目（200920137007）

王冰（1988—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：hnwangbingforever@126.com

*通信作者：劉睿（1969—），男，副教授，博士，研究方向為蜂產(chǎn)品深加工及質量安全。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn