溫曉文 吳迪炯 葉寶東 羅赟飛 吳逢選 周郁鴻

鐵過載是由于機體內(nèi)鐵供給超過鐵的需要、鐵利用障礙、相關基因突變等原因而導致鐵在某些組織器官中貯存增加的病理現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載不僅常見于一些血液系統(tǒng)疾病，如原發(fā)性血色病、地中海貧血、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、原發(fā)性骨髓纖維化等疾病因長期輸血或疾病本身原因造成鐵過載，還廣泛涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等諸多方面疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、病毒性肝炎等［1］。過量的鐵不僅影響心、肝、胰腺等臟器功能和結構，而且與血液系統(tǒng)造血紊亂密切相關，對機體有著十分重要的危害。而隨著鐵過載的研究深入，構建鐵過載鼠模型，已經(jīng)是研究工作中不可缺少的一個重要環(huán)節(jié)。現(xiàn)將慢性鐵過載鼠模型的研究作一綜述。

一、模型的復制方法

1.注射鐵劑法:采用皮下或腹腔給鼠注射右旋糖酐鐵或蔗糖鐵，超過機體對鐵所需，導致鐵在體內(nèi)沉積。動物出現(xiàn)精神萎靡，生長速率減慢，皮毛粗糙等變化。實驗室檢查可見鐵含量指標(如血清鐵、鐵蛋白、組織鐵等)增高，抗氧化應激指標(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素E 等)降低。該法是目前慢性鐵過載鼠模型造模中應用最多的，其經(jīng)典模型是Bartfay 等［2］在20 世紀末所建立。該實驗為以后的研究奠定了基礎，為其他研究者提供了借鑒。

在實驗用鼠的選擇上，學者們尚未達到共識，故當前造模所涉及的鼠品系較為雜亂，但大鼠以沙土鼠多見，小鼠以Balb/c 鼠為主。現(xiàn)階段尚無公認的注射鐵劑法鐵過載鼠模型的報道，造模過程中，鐵劑劑量、注射頻率、注射時間等選擇上仍有差異［3］。文獻報道右旋糖酐鐵有“100mg/kg 隔天1 次×5 次”或“60mg/kg 隔天1 次×5 次”或“200mg/kg 每周1 次×10 次”等用法［4～7］。進一步研究表明組織鐵濃度與注射鐵劑劑量呈正相關，血清鐵(serum iron，SI)含量主要受注射總時間影響［3］。在研究鐵劑劑量與肝內(nèi)氧自由基和維生素E 濃度的實驗中，Karey 等［8］予小鼠腹腔注射不同總劑量的右旋糖酐鐵(100、200、400mg/kg)。實驗結束后發(fā)現(xiàn)，注射總劑量與肝臟鐵濃度、丙二醛(malondialdehyde1，MDA)呈正相關，而與血中維生素E 含量呈負相關。

2.羰基鐵法:羰基鐵法見于大量的原發(fā)性血色病慢性鐵過載模型中。該方法予鼠長期進食富含羰基鐵的飼料，最終導致鐵在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)沉積，達到建模目的。Christelle 等［9］將Balb/cJ 小鼠分成4組，分別喂以含有0%、0.5%、1.5%、3%的羰基鐵的飼料，并在實驗第2、4、8、12 個月處死每組部分小鼠，以觀察造模情況。研究發(fā)現(xiàn):肝臟鐵濃度隨著飼料中羰基鐵含量以及喂養(yǎng)時間的增加而增加;而肝細胞異常有絲分裂、肝纖維化只現(xiàn)于3%組。同樣，Beatrice等［10］實驗表明，喂有含3%羰基鐵的飼料小鼠8 周后與正常組(喂以普通飼料)相比，肝臟鐵濃度(2078 ±810/139 ±12μg/g)、丙氨酸氨基轉移酶(24 ±5/18 ±2U/L)、肝臟與體重之比(6. 7% ± 0. 4% /4. 8% ±0.4%)均有明顯差異?；谝陨险J識，目前研究者在羰基鐵含量的選擇上以3%為主，根據(jù)實驗的需要，喂養(yǎng)時間上有4、8、12 周等區(qū)別［11］。由于喂養(yǎng)時間、鼠的品系、鼠齡等差異，故實驗終點時鐵過載程度亦有所不同。

3. 基因剔除法:鐵代謝相關基因HFE、TfR2、HAMP 等變異，是導致原發(fā)性血色病發(fā)生的根本原因。HFE 基因C282Y 突變可以使HFE 分子不能與β2微球蛋(β2-microglobulin，β2m)結合，不能轉運到細胞表面，從而失去對轉鐵蛋白和轉鐵蛋白受體的調(diào)節(jié)功能。過去研究顯示，缺乏β2m 的小鼠與原發(fā)性血色病類似的肝臟存在鐵過載。Santos 等［12］給β2m基因敲除小鼠和正常小鼠喂以普通飼料或含有2.5%的羰基鐵的飼料，2 或4 個月后，β2m 基因敲除小鼠肝臟鐵濃度顯著高于正常組，β2m 基因敲除小鼠喂以羰基鐵飼料后其鐵過載程度明顯大于單純基因敲除小鼠。他們的實驗同時為兩種方法聯(lián)合的研究提供了可能。骨形態(tài)形成蛋白6 (bone morpho -genetic protein 6，Bmp6)通過調(diào)節(jié)hepcidin 水平，影響機體的鐵代謝［13］。Bmp6 基因剔除小鼠，其信號轉導分子Smad1、Smad5、Smad8 水平明顯降低，hepcidin 合成減少，鐵在肝臟、胰腺、心臟、腎快速且大規(guī)模沉積［14］。而Majda 等［15］研究則進一步表明，Bmp6 基因剔除小鼠存在視網(wǎng)膜鐵過載。

二、模型的評價方法

基于當前缺乏診斷鼠鐵過載的金標準，當上述方案達到造模目的時，評價模型的終點指標的選擇及其范圍(表1)有所不同。在指標選擇上除肝鐵濃度、血清鐵蛋白(serum ferritin，SF)、組織鐵染色即能直接反應體內(nèi)鐵沉積程度的指標外，還選擇能反應氧化應激的指標如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽、谷胱甘肽S 轉移酶等，以及肝功能的指標。后兩者的改變可繼發(fā)于鐵過載，故可間接反應鐵過載。此外，從病理上看，鐵過載時肝細胞呈廣泛變性、點狀液化性壞死，或伴有輕微纖維化［11］;小鼠心外膜及心肌間質(zhì)均可見大量漿細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，心肌間質(zhì)可見出血、水腫等病理變化［16］;脾臟可出現(xiàn)小體萎縮，周圍及脾竇纖維組織增生，且隨著鐵過載含量增加，纖維化更加明顯;腎臟腎小球變小，腎小管擴張內(nèi)見紅染無結構物質(zhì)。

雖然前述的模型方法在造模過程中各有特點(或增加鐵負荷或?qū)е妈F代謝紊亂)，但它們均以鐵在組織過量沉積為最終效應。故在模型評價上均應以直接反應體內(nèi)鐵濃度的指標為基礎(如SI、SF、肝鐵濃度、組織鐵染色等)，輔以氧化應激指標(MDA、SOD、谷胱甘肽等)。筆者認為肝是體內(nèi)鐵沉積的首要器官，肝鐵濃度能很好反應體內(nèi)鐵沉積程度，是診斷人類鐵過載的金標準，其應亦是診斷鼠鐵過載的金標準。然而各鼠有品系之別，鼠鐵過載時肝鐵濃度的數(shù)值確定還需進一步探討。

表1 注射鐵劑法［4 ～7］和羰基鐵法［9］達到造模目的的相關指標范圍

三、小 結

長期從胃腸攝入羰基鐵，不能很好模仿臨床繼發(fā)性鐵過載鐵在肝、脾、心等貯鐵器官的沉積及其毒性作用，故羰基鐵法主要用于原發(fā)性鐵過載模型的建立，優(yōu)點是操作簡單、病死率低，而缺點是造模周期長。注射鐵劑法被許多學者用于建立繼發(fā)性鐵過載模型，其具有復制周期短，成功率高，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢;基因剔除法只限于特異的基因研究，實驗操作復雜，條件要求高。

筆者認為以上3 種造模方法各有其適用范圍，然而具體到鐵過載肝、心、胰腺等臟器研究則缺少針對性，至今還無鐵過載鼠模型關于血液系統(tǒng)的研究。注射鐵劑法、羰基鐵法的應用上，采用大劑量可以加深組織鐵沉積，而延長注射或喂養(yǎng)鐵的時間可使SI、SF維持高的濃度。鐵代謝相關基因如HFE、TfR2、HAMP 的剔除，從基因水平上驗證該基因在鐵過載發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為鐵過載的研究提供新的思路。

1 中華醫(yī)學會血液學分會/中國醫(yī)師協(xié)會血液科醫(yī)師分會. 鐵過載診斷與治療的中國專家共識［J］.中華血液雜，2011，32(8):572 -574

2 Bartfay WJ，Hou D，Brittenham GM，et al.The synergistic effects of vitamin E and selenium in iron-overloaded mouse Hearts［J］. Can J Cardiol，1998，14(7):937 -941

3 Bá Vu'o'ng Lê，Hafida KC，Anne-Sophie V，et al.New rat models of iron sucrose-induced iron overload［J］.Experimental Biology and Medicine，2011，236:790 -799

4 Rhitajit S，Bibhabasu H，Nripendranath M.Hepatoprotective potential of caesalpinia crista against iron -overload -induced liver toxicity in mice［J］. Evidence - Based Complementary and Alternative Medicine，2012，2012:896341

5 Zhang Y，Huang Y，Deng XR，et al.Iron overload-induced rat liver injury:Involvement of protein tyrosine nitration and the effect of baicalin［J］. European Journal of Pharmacology，2012，680(2012)95 -101

6 Lu NH，Li XL，L JY，et al. Nitrative and oxidative modifications of enolase are associated with iron in iron - overload rats and in vitro［J］. J Biol Inorg Chem，2011，16:481 -490

7 Maya OD，Casey B，Ignacio G，et al.Safety and efficacy of combined chelation therapy with deferasirox and deferoxamine in a gerbil model of iron overload［J］. Acta Haematol，2008，120(2):123 -128

8 Karey D，McCullough，MScN，et al.The dose -dependent effects of chronic iron overload on the production of oxygen free radicals and vitamin E concentrations in the liver of a murine model［J］. Biol Res Nurs，2007，8(4):300 -303

9 Christelle P，Bruno T，Theodore CI，et al.Carbonyl-iron supplementation induces hepatocyte nuclear changes in BALBKJ male mice［J］.Journal of Hepatology，1999，30:926 -934

10 Beatrice A，Benedetta L，Giuseppe L，et al. Iron overload enhances the development of experimental liver cirrhosis in mice［J］.The International Journal of Biochemistry＆Cell Biology，2003，35 (2003):486-495

11 Emilie C，Emmanuelle A，Nadia F，et al.Hepcidin induction limits mobilisation of splenic iron in a mouse model of secondary iron overload［J］. Biochimicaet Biophysica Acta，2010，1802 (2010):339 -346

12 Santos M，Schilham MW，Rademakers LHPM，et al，Clevers H:Defective iron homeostasis inβ2 - microglobulin knockoutmice recapitulates hereditary hemochromatosis in man［J］. J Exp Med 1996，184:1975 -1985

13 Andriopoulos BJ，Corradini E，Xia Y，et al.BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin expression and iron metabolism［J］. Nat Genet，2009，41:482 -487

14 Meynard D，Kautz L，Darnaud V，et al.Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload［J］. Nat Genet.2009，41(4):478 -481

15 Majda H，Song，Natalie W，et al.Bmp6 regulates retinal iron homeostasis and has altered expression in age-related macular degeneration［J］.The American Journal of Pathology，2011，179(1):335 -347

16 姜晨輝，何歡，王飛，等. 阿魏酸鈉對小鼠鐵過載性心臟損傷的作用［J］.南昌大學學報，2012，52(9):14 -18

17 Cathew P，Dorman BM，Edward RE，et al.A unique rodent model for both cardiotoxic and hepatotoxic effects of prolonged iron overload［J］.Laboratory Investigations，1993，69，217 -222