張煒華 吳慶光 曾 寶 易智彪 賴小平 余劍平 魏秀娟 甘智誠

產(chǎn)于東莞地區(qū)的白木香被稱之為莞香，是我國唯一以地區(qū)而得名的植物，其藥材來源為瑞香科植物白木香［Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.］含有樹脂的心材。具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘等功效，臨床常用于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥的治療［1］。目前莞香資源的開發(fā)利用僅限于其藥用部位(含樹脂心材)的研究，而莞香葉作為該植物最為豐富的資源部位，其藥理研究卻寥寥無幾。本課題組前期研究結(jié)果表明，莞香葉中含有大量的以芒果苷為代表的雙苯吡酮類化合物-芒果總苷(包括芒果苷、異芒果苷、高芒果苷等)，而黃酮類化合物一般具有抗炎、抗氧化、抗菌、降壓、降脂等多重藥效活性［2］。因此本實(shí)驗(yàn)擬從抗炎鎮(zhèn)痛藥效作用入手，來探討莞香葉中芒果總苷抗炎鎮(zhèn)痛的作用效果，以期為莞香資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)實(shí)驗(yàn)藥品:①受試藥物:莞香葉(批號(hào):20130523)，于2013 年6 月采自廣東省東莞市沉香規(guī)范化種植基地，經(jīng)東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院賴小平研究員鑒定為瑞香科植物白木香［Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.］帶有嫩枝的葉片，60℃烘干12h 后粉碎，過4 號(hào)篩，備用;②陽性對照藥:醋酸地塞米松片，規(guī)格0.75 毫克/片，浙江仙琚制藥生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào):100405。羅通定片，規(guī)格30 毫克/片，成都市湔江制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào):H51021203。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:KM 種小鼠，體重18 ～22g，雌性［SPF 級(jí)別，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(粵)2008 -0020］。(3)主要試劑:芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品(由本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)島津HPLC-DAD 檢測，純度≥98%);AB-8 大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司，批號(hào):100805);伊文思蘭(CAS:314 -13 -6，aladdin，廣州東巨儀器有限公司代銷);二甲苯(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào):100506);冰醋酸(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào):100709);(4)主要儀器:BSIIOS 萬分之一分析天平(香港佳立國際有限公司);TU1810 型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);YLS -6A 智能熱板儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)芒果總苷的制備:稱取干燥的莞香葉粉末1kg 分置于圓底燒瓶中，以10 倍量石油醚回流脫脂2 次，每次1h，濾過，濾渣通風(fēng)廚內(nèi)放置24h 揮干。再將揮干的濾渣置于圓底燒瓶中，加入8 倍量70%乙醇，回流3 次，每次1h，濾過，合并濾液。將上述濾液真空減壓濃縮至稠膏狀得總浸膏，將總浸膏混懸于適量水中，依次別用乙醚、正丁醇按1∶1體積各萃取3 次，收集正丁醇部位［3］。將該部位徹底揮干溶劑，得正丁醇部位干膏，將該干膏混懸于少量水中，過AB -8 大孔樹脂柱(上樣質(zhì)量濃度10mg/ml，流速1.5BV/h)，分別以水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇梯度洗脫，各濃度3 倍柱體積。收集30%乙醇部位。將收集到的大孔樹脂30%乙醇部位濃縮后過聚酰胺層析柱，分別用蒸餾水及不同濃度的乙醇洗脫，經(jīng)聚酰胺薄層色譜點(diǎn)樣，以1%三氯化鋁為顯色劑，合并在365nm 紫外波長下顯亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)的流分，揮干溶劑，得莞香葉芒果總苷部位［3］。(2)芒果總苷的含量測定:對所得浸膏中芒果總苷進(jìn)行含量測定，以便后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確給藥。1)對照品的選擇:本實(shí)驗(yàn)采用芒果苷作為對照品，該化合物由本實(shí)驗(yàn)室自芒果葉中分離得到，經(jīng)島津HPLC -DAD檢測，純度≥98%。2)對照品溶液制備:精密稱取芒果苷對照品20.0mg 置50ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.4mg/ml 的芒果苷對照品溶液。3)供試品溶液制備及測定波長的選擇:取得到的莞香葉芒果總苷粉末10.0mg 置100ml 容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.1mg/ml 的供試品溶液。以甲醇為空白溶液進(jìn)行調(diào)零，使用紫外分光光度計(jì)在190 ～800nm 對該供試品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液全波長掃描，確定其最大吸收波長。4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml 于10ml 容量瓶中，定容至刻度后分別測定其OD 值，以對照品溶液濃度(C，μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。5)樣品的含量測定:取樣品溶液0.2ml 于10ml 容量瓶中，同時(shí)吸取甲醇溶液適量作空白溶液，于258nm 波長處測其OD 值。并計(jì)算所得莞香葉芒果總苷部位粉末中芒果總苷的準(zhǔn)確含量。

結(jié) 果

1.芒果總苷制備結(jié)果:按實(shí)驗(yàn)方法中“芒果總苷的制備”項(xiàng)下經(jīng)制備得:正丁醇部位干膏187.62g，并最終得到淡黃色固體粉末(莞香葉芒果總苷)15.73g，占原藥材總量的1.57%［3］。

2.測定波長:按“供試品溶液制備及測定波長的選擇”項(xiàng)下，以甲醇為空白溶液進(jìn)行調(diào)零，使用紫外分光光度計(jì)在190 ～800nm 對該供試品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液全波長掃描，確定其最大吸收波長為258nm，故確定258nm 為測定波長。

圖1 紫外全波長掃描

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線:按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下于258nm 波長處測定吸光度。以對照品溶液濃度(C，μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:y =0. 0376x +0. 0151，r =0.999。結(jié)果表明芒果苷在4 ～24μg/ml 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

4.含量測定結(jié)果:按“樣品的含量測定”項(xiàng)下于258nm 波長處測定樣品的OD 值為0.565。經(jīng)計(jì)算得，所得莞香葉芒果總苷部位粉末中芒果總苷含量為73.16%。

5.抗炎鎮(zhèn)痛藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn):與空白對照組比較，醋酸地塞米松可顯著降低小鼠腹腔洗滌液的吸光度值(P ＜0.05)，提示造模成功，實(shí)驗(yàn)方法可行，詳見表1。與空白對照組比較，莞香葉芒果總苷高、中劑量能夠顯著抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性(P ＜0.05)。與醋酸地塞米松組比較，莞香葉芒果總苷高、中劑量組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性無顯著差異(P ＞0.05)，提示莞香葉芒果總苷能夠顯著抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的急性炎癥反應(yīng)，具有抗炎藥效。(2)二甲苯致小鼠耳腫脹抑制實(shí)驗(yàn):與空白對照組比較，陽性藥醋酸地塞米松可顯著抑制二甲苯致炎小鼠的耳廓腫脹度(P ＜0.05)，提示造模成功，實(shí)驗(yàn)方法可行，詳見表2。與空白對照組比較，莞香葉芒果總苷高、中、低劑量均可顯著降低二甲苯致炎小鼠的耳腫脹度(P ＜0.05)。與醋酸地塞米松組比較，莞香葉芒果總苷高、中劑量組小鼠耳腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，提示莞香葉芒果總苷能夠顯著抑制二甲苯致炎小鼠的耳廓腫脹度，具有抗炎藥效。(3)小鼠熱板痛閾實(shí)驗(yàn):與空白對照組比較，羅通定組小鼠在給藥后各時(shí)間點(diǎn)痛閾提高百分率顯著升高(P ＜0.01)，提示造模成功，實(shí)驗(yàn)方法可行，詳見表3。結(jié)果顯示，莞香葉芒果總苷高劑量組的痛閾提高百分率在給藥后60 ～120min 顯著高于空白對照組(P ＜0.05)。莞香葉芒果總苷中劑量組的痛閾提高百分率在給藥后90 ～120min 顯著高于空白對照組(P ＜0.05)。莞香葉芒果總苷低劑量組的痛閾提高百分率在給藥后各時(shí)間段與空白對照組比較均無顯著性差異(P ＞0.05)。提示莞香葉芒果總苷高、中劑量給藥能夠顯著增加小鼠的痛閾提高百分率，具有鎮(zhèn)痛藥效。(4)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn):與空白對照組比較，羅通定可顯著延長小鼠扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間和減少小鼠20min 內(nèi)扭體次數(shù)(P ＜0.01)，提示造模成功，實(shí)驗(yàn)方法可行，詳見表4。與空白對照組比較，莞香葉芒果總苷高、中劑量組能夠顯著延長小鼠扭體反應(yīng)潛伏期時(shí)間(P ＜0.05)。同時(shí)，與空白對照組比較，莞香葉芒果總苷各劑量組均可顯著減少小鼠20min 內(nèi)扭體次數(shù)(P ＜0.05)。與羅通定組比較，莞香葉芒果總苷各劑量組小鼠20min 內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)均無顯著差異(P ＞0.05)。提示莞香葉芒果總苷能夠能夠顯著減少醋酸所致小鼠20min 內(nèi)扭體次數(shù)，具有鎮(zhèn)痛藥效作用。

表1 莞香葉芒果總苷對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響(±s，n=10)

表1 莞香葉芒果總苷對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響(±s，n=10)

與空白對照組比較，* P ＜0.05，與醋酸地塞米松組比較，#P ＜0.05

組 別 劑量(mg/kg)(以芒果總苷計(jì))OD 值0.200 ±0.025醋酸地塞米松組 2 0.143 ±0.047*莞香葉芒果總苷高劑量組 56 0.150 ±0.039*莞香葉芒果總苷中劑量組 28 0.164 ±0.027*莞香葉芒果總苷低劑量組 14 0.198 ±0.024空白對照組-#

表2 莞香葉芒果總苷對二甲苯致小鼠耳腫脹抑制作用的影響(±s，n=10)

表2 莞香葉芒果總苷對二甲苯致小鼠耳腫脹抑制作用的影響(±s，n=10)

與空白對照組比較，* P ＜0.05，與醋酸地塞米松組比較，#P ＜0.05

組別 劑量(mg/kg)耳腫脹度(mg)抑制率(%)- 13.85 ±1.41 -醋酸地塞米松組 2 7.06 ±1.39* 49.03莞香葉芒果總苷高劑量組 56 7.39 ±1.96* 46.64莞香葉芒果總苷中劑量組 28 7.60 ±2.53* 45.13莞香葉芒果總苷低劑量組 14 9.35 ±1.75* #空白對照組32.49

表3 莞香葉芒果總苷對熱刺激小鼠痛閾提高百分率的影響(±s，n=10)

表3 莞香葉芒果總苷對熱刺激小鼠痛閾提高百分率的影響(±s，n=10)

與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別30min 60min 90min 120min空白對照組 -18.72 ±16.28 -17.56 ±20.19 -17.34 ±12.87 -19.91 ±12.85羅通定組 73.43 ±21.88* 82.32 ±32.61* 86.52 ±22.02* 87.68 ±26.94*莞香葉芒果總苷高劑量組 42.48 ±11.27 68.14 ±21.62* 78.08 ±13.59* 81.62 ±13.84*莞香葉芒果總苷中劑量組 26.81 ±20.67 44.78 ±19.22 55.84 ±16.95* 58.28 ±21.06*莞香葉芒果總苷低劑量組 6.52 ±3.89 7.67 ±2.83 35.55 ±13.13 37.86 ±12.25

表4 莞香葉芒果總苷對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

表4 莞香葉芒果總苷對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

與空白對照組比較，* P ＜0.05;與羅通定組比較，#P ＜0.05

組別 給藥劑量(mg/kg) 扭體潛伏期(s) 20min 內(nèi)扭體次數(shù) 鎮(zhèn)痛抑制率(%)211.9 ±31.7 51 ±8 -羅通定組 60 405.3 ±40.6* 26 ±5* 49.01莞香葉芒果總苷高劑量組 56 267.7 ±24.8* # 26 ±4* 49.01莞香葉芒果總苷中劑量組 28 247.1 ±39.1* # 28 ±7* 45.10莞香葉芒果總苷低劑量組 14 219.8 ±26.4# 30 ±5*空白對照組-41.18

討 論

本實(shí)驗(yàn)首先以莞香葉為原料，通過提取、萃取、大孔樹脂層析譜、聚酰胺色譜等一系列分離純化手段，得到該藥材芒果總苷部位。并醋酸地塞米松為陽性藥，通過醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性模型與二甲苯致小鼠耳腫脹模型，評價(jià)莞香葉芒果總苷的抗炎藥效學(xué)作用，以羅通定為陽性藥，通過小鼠熱板模型與醋酸致小鼠疼痛模型，評價(jià)莞香葉芒果總苷的鎮(zhèn)痛藥效學(xué)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莞香葉芒果總苷對于上述4 種動(dòng)物模型均具有顯著的藥理作用，證明莞香葉芒果總苷具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛藥效。

關(guān)于莞香葉(沉香葉)抗炎藥效學(xué)研究，有過一些相關(guān)報(bào)道，但類似研究較為粗略，研究目標(biāo)僅僅為沉香葉水提液以及醇提液，未見相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步深入研究［6］。本課題組通過前期相關(guān)篩選研究，將莞香葉抗炎鎮(zhèn)痛物質(zhì)基礎(chǔ)確定在其芒果總苷部位進(jìn)行相關(guān)研究，明確了莞香葉抗炎鎮(zhèn)痛物質(zhì)基礎(chǔ)，對莞香資源的藥效開發(fā)利用提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

芒果苷又名莞知母寧，是一種具有雙苯吡酮結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物。除莞香葉外，此類物質(zhì)也是知母及芒果葉的指標(biāo)性成分之一。關(guān)于其他藥材中芒果苷抗炎藥效學(xué)研究已有相關(guān)報(bào)道，但在莞香葉中由于其同分異構(gòu)體存在較多，形成了以芒果苷為主，各種同分異構(gòu)化合物并存的現(xiàn)象［2］。各單體化合物由于具有相似的母核結(jié)構(gòu)，因而在抗炎鎮(zhèn)痛藥效方面起著協(xié)同作用，故本實(shí)驗(yàn)以莞香葉芒果總苷部位為研究對象，能夠在充分發(fā)揮莞香葉抗炎藥效的同時(shí)，減少單個(gè)化合物的用量，簡化分離工藝流程。

由于莞香葉未被藥典及部頒標(biāo)準(zhǔn)收載，其芒果總苷部位也未有相關(guān)藥效學(xué)研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)參考藥典規(guī)定知母中芒果苷用量進(jìn)行折算而確定其給藥劑量。藥典規(guī)定知母每日用法用量為:口服，每日12g;干品知母中芒果苷含量≥0.70%，即芒果苷攝入量最低應(yīng)為84mg/d，故本實(shí)驗(yàn)中芒果總苷用量設(shè)為1.4mg/kg 體重［5，7］。

1 林煥澤，李紅念，梅全喜，等.沉香葉的研究進(jìn)展［J］. 今日藥學(xué)，2011，21 (9):547 -549

2 馮潔，楊秀偉. 白木香葉化學(xué)成分的研究［J］. 中國中藥雜志，2012，37 (2):230 -234

3 李文琪，陳明生，溫幼敏，等.光石韋藥材中芒果苷的定性定量分析方法研究［J］. 廣西科學(xué)，2012，19 (1):77 -79

4 鄧勝國，鄧澤元，范亞葦，等. 紫外分光光度法測定荷葉總黃酮含量［J］. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32 (2):148 -150

5 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:223

6 余伯陽.一種沉香葉提取物及其醫(yī)藥和保健用途［P］. 中國專利:200710019969.3.2007 -08 -08

7 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(一部)［M］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:74