王進英 鐘海雁

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長沙 410004)(糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點實驗室2，長沙 410004)

茶油是我國特有的傳統(tǒng)木本食用植物油之一，茶油中含有的酚類物質(zhì)具有具有良好的自由基清除作用[1]，其抗氧化效果明顯優(yōu)于生育酚[2]，從而能有效的抑制油脂的氧化保證茶油具有良好的儲藏穩(wěn)定性[3-4]。

目前各種植物中酚類物質(zhì)含量測定方法要分為總酚含量的測定[5-7]和各酚類組分單體分析[8]，這2種分析方法也應(yīng)用于茶油中酚類物質(zhì)的分析。丁明等[9]采用Folin-Ciocaltea 法測定了茶油中的總酚。羅凡等[10]建立了同時分離、檢測茶油中23 種酚類物質(zhì)的高效液相色譜外標標準曲線法。國外，在橄欖油的研究中采用以丁香酸為內(nèi)標物的內(nèi)標法對橄欖油中的酚類物質(zhì)進行定性和定量分析[11]。內(nèi)標法標準曲線結(jié)合了峰面積歸一法和外標法，它是在加入內(nèi)標物后，按峰面積歸一法進行定量，避免了由于進樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的誤差，它的分析精密度也較高，是液相色譜的一種比較理想的定性和定量分析方法[12]。本試驗建立了油茶籽油中天然酚類物質(zhì)含量的高效液相色譜內(nèi)標標準曲線分析方法，分析測定茶油中的多酚，特別是簡單多酚，為進一步研究油茶籽油中酚類物質(zhì)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶油樣品如表1所示。

表1 茶油樣品信息表

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

1200型高效液相色譜儀：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Agilent公司；UV-1800紫外可見分光光度儀：日本島津公司；Diol 二醇基-SPE(6 mL，500 mg)固相萃取小柱：美國Supelco公司；SEP5010型固相萃取真空裝置：日本島津公司；MD200-1氮氣吹掃儀：杭州奧盛儀器有限公司；AL204型電子天平：Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；FE20型pH計： Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；B5510E-DTH型臺式超聲波清洗機：美國Branson公司；DW-86L628型超低溫冰箱：海爾公司；英國ELGA分析型超純水系統(tǒng)：上海恒奇儀器儀表有限公司。

1.2.2 試劑與標準品

沒食子酸、3，4-二羥基苯乙酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、丁香酸、鄰香草醛、2-羥基肉桂酸、槲皮素對照品：美國Sigma公司。甲醇：色譜純，美國TEDIA天地試劑公司；乙酸(色譜純)、乙酸乙酯(分析純):天津市化學(xué)試劑研究所；分析純正已烷：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超純水：英國ELGA分析型超純水系統(tǒng)制取。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)標標準溶液的制備

準確稱取15 mg丁香酸標準品，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得內(nèi)標標準溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別稱取沒食子酸對照品41.25 mg，3,4-二羥基苯乙酸對照品75 mg，兒茶素對照品81.25 mg，4-羥基苯乙酸116.3 mg，鄰香草醛對照品50 mg，2-羥基肉桂酸對照品10 mg，槲皮素對照品68 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

準確稱取2. 5 g茶油，溶于6 mL正己烷中，將二醇基固相萃取柱置于真空洗脫設(shè)備中，分別連續(xù)過6 mL甲醇和6 mL正己烷，釋放真空，將油溶液過柱，此時樣品留在固相上，分別用3 mL正己烷過柱清洗2次，再用4 mL正己烷- 乙酸乙酯( 90∶10) 過柱，最后用10 mL甲醇洗柱，加入1 mL丁香酸內(nèi)標標準溶液，氮吹儀吹干，殘渣溶于1 mL甲醇-水(1∶1) 中，過0. 45 μm濾膜，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：ORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；柱溫： 25 ℃；檢測波長：280 nm；流動相：A(甲醇)，B(0.2%乙酸)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

由于酚類化合物常帶有酚羥基，在水中會部分解離。而未解離的羥基與固定相作用較強，導(dǎo)致拖尾。所以僅用甲醇水作流動相很難實現(xiàn)標樣的完全分離[13]。梯度洗脫中在水相中加入一定的酸分離效果和峰型明顯改善[14]。羅凡等[10]分別以1% 甲酸、0.1%甲酸、0.2%乙酸與甲醇作為流動相采用相同的梯度洗脫條件進行分離，結(jié)果表明 0.2%乙酸與甲醇為最適流動相。本試驗中以甲醇(A)和含0.2%乙酸的水(B)作為流動相，對油樣1選取3個洗脫程序?qū)τ蜆舆M行洗脫，色譜圖如圖1 所示。

圖1 3種梯度洗脫分離油樣的液相色譜圖(280 nm)

由圖1可以看出，在3個洗脫梯度中，梯度3的分離效果最好，尤其是在25～35 min之間，使各物質(zhì)達到了良好分離，而且基線漂移現(xiàn)象得到了一定改善，梯度3的洗脫程序如表2所示。

2.1.2 檢測波長的選擇

通過紫外分光光度計對8種酚類的標樣溶液在200～400 nm內(nèi)進行全波長掃描，得到各物質(zhì)的8種酚類物質(zhì)的紫外吸收光譜圖，如圖2所示。從圖2可以看出，在215 nm和280 nm都有較強的吸收，研究表明215 nm處基線噪聲較大，檢測效果不好[15]。經(jīng)試結(jié)合各種酚類物質(zhì)研究文獻[16-20]中對檢測波長的選擇，在吸收波長為280 nm時，各標準品都具有較大吸收，分離效果、峰型最好，且各種酚都得到了完全分離?？疾鞓悠吩诒綡PLC條件下的實際吸收情況，選定280 nm為檢測波長。

圖2 各種酚類化合物的紫外吸收光譜圖

2.1.3 內(nèi)標物質(zhì)的選擇

內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物，內(nèi)標物應(yīng)該是原樣品中不存在的純物質(zhì)，它的性質(zhì)應(yīng)盡可能與被測組分相近，不與被測樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時要能完全溶于被測樣品中。內(nèi)標物的峰應(yīng)盡可能接近被測組分的峰，或位于幾個被測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊[21]。本試驗參照國外橄欖油研究[22-24]，選定丁香酸為內(nèi)標物質(zhì)。

2.2 內(nèi)標標準曲線與線性范圍

2.2.1 相對校正因子的測定

取1.3.2中對照品溶液注入高效液相色譜儀，平行測定6次，相對校正因子按式：f=(As×mi) /(Ai×ms) 計算，式中：As為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積；Ai為對照品的峰面積；ms為內(nèi)標物質(zhì)溶液的質(zhì)量；mi為對照品溶液的質(zhì)量。測定結(jié)果如表3所示，其相對標準偏差在3.2%以內(nèi)。

表3 8種組分的絕對校正因子及相對校正因子(n=6)

2.2.2 線性試驗

取“1.3.2”對照品溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于10 mL容量瓶中，各加1 mL丁香酸內(nèi)標標準溶液，加甲醇定容值刻度，制成具有濃度梯度的一系列溶液，在優(yōu)化色譜條件下依次進樣分析。以各種酚類物質(zhì)的峰面積與丁香酸峰面積的比值作為縱坐標(Ai/As)，以各種酚類物質(zhì)的含量與丁香酸含量比值為橫坐標(mi/ms)，繪制標準曲線，進行回歸計算，得回歸方程。假設(shè)高效液相色譜儀最低相應(yīng)值S=3N(N為儀器噪音水平)，以S/N=3時，所對應(yīng)標準溶液中所含組分的含量為檢出限，結(jié)果見表4。7種酚類物質(zhì)在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限為0.008～0.028 μg /g，能滿足定量分析的要求。

表4 7種組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性

按照“1.3.3”制備油樣3的供試樣品1份，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖。試驗結(jié)果表明，樣品在室溫條件下在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定，各色譜峰的相對標準偏差在2%左右。

2.3.2 精密度

取“1.3.2”中所列對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)測定6次，測得各組分的保留時間和峰面積的RSD，以考察方法的精密度。如表5所示， 8種物質(zhì)的保留時間和峰面積的RSD分別小于1.8%和3.9%，表明本法精密度較好。

表5 8種酚類物質(zhì)的保留時間和峰面積精密度試驗(n=6)

2.3.3 重復(fù)性試驗

以8號油樣為樣品，按照“1.3.3”制備供試樣品6份，在優(yōu)化色譜條件下進樣分析，測得7種組分的平均含量，如表6所示，RSD 小于3%。

表6 1號油樣中7種酚類物質(zhì)的含量(n=6)

2.3.4 回收率

取8號油樣3份，分別加入一定濃度的混合標準溶液，按“1.3.3”樣品溶液制備方法項下制備，測定含量，計算回收率和RSD，結(jié)果見表7。從表7可以看出，各組平均回收率為在76.783%～88.956%之間，RSD在3%左右(n=3)，表明樣品在前處理過程中有一定的損失，在樣品處理過程中應(yīng)進一步優(yōu)化提取條件。

表7 茶油中7種酚類物質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差(n=3)

2.4 實際樣品測定

取1～7號油樣各2.5 g，按照“1.3.3”制備供試樣品3份，在已確定的色譜條件下進樣分析，測得每種物質(zhì)的峰面積，根據(jù)每種物質(zhì)的線性回歸方程計算出各酚類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，在選定的7種酚類物質(zhì)中，茶油中只含有其中的4種，分別為沒食子酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、槲皮素，7個油樣中4種酚類物質(zhì)的含量如表8 所示。選定7種多酚作為標準樣品主要是根據(jù)前人的研究結(jié)果進行的[10]。但本次供試的樣品中僅檢測到其中的4種，其主要的原因可能是其余3種多酚含量較低，因此，前處理方法，如油樣提取物中多酚的富集，仍是值得研究的問題，這樣有利于較全面地認識茶油的多酚組成。

表8 茶油中4種組分含量/μg/g(n=3)

3 結(jié)論

選用丁香酸為內(nèi)標物，對樣品前處理和色譜分析條件都進行優(yōu)化選擇后，建立了反相高效液相色譜內(nèi)標標準曲線法同時測定茶油中7種酚類物質(zhì)的方法。試驗結(jié)果表明，在選定的7中酚類物質(zhì)中茶油只含有其中的4種，分別是沒食子酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、槲皮素，而且這4種物質(zhì)在8個油樣中的含量各異，這可能與茶油的加工方法和品種有關(guān)。該方法準確，適用性好，可用于茶油中酚類物質(zhì)的定性與定量分析。

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