呂延成 潘曉瑜 黃暢 丁娟

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生化與分子細(xì)胞生物學(xué)教研室，珠海 519040）

Ⅱ型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）是生殖器皰疹（GH）的主要病原體。HSV-2 一旦感染將終身潛伏在骶神經(jīng)節(jié)［1，2］。近年來的研究認(rèn)為，Ⅱ型單純皰疹病毒感染和艾滋病［3］、宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)性［4-7］，國(guó)內(nèi)外研究顯示HSV-2 患病率呈不斷上升趨勢(shì)［8］。目前治療生殖器皰疹主要使用廣譜抗病毒藥物，治療的目的主要是緩解癥狀，縮短病程，減輕疼痛及防止繼發(fā)感染等［9，10］。同時(shí)隨著各種激素的大量使用，HSV-2病毒耐藥性有逐漸增加的趨勢(shì)［11，12］。因此，尋找新的抗病毒治療策略，研制新型抗病毒藥物已成為當(dāng)今HSV-2 感染后治療的研究熱點(diǎn)。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）能夠使mRNA 發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種新型的基因阻斷技術(shù)，能高效、特異的抑制基因表達(dá)。運(yùn)用RNAi 干擾技術(shù)抑制病毒增殖和感染是當(dāng)前抗病毒研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一［13-16］，目前國(guó)內(nèi)外運(yùn)用RNAi 技術(shù)，特別是聯(lián)合干擾對(duì)HSV-2 的研究報(bào)道較少。

HSV-2 是生殖器皰疹的主要病原體，UL27、UL29 都在病毒感染過程中起重要作用，因此以UL27 基因、UL29 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療具有廣闊前景。HSV-2 UL27 基因編碼的gB 蛋白是在感染細(xì)胞中含量最多的糖蛋白，gB 的胞漿區(qū)是12 個(gè)包膜糖蛋白中最長(zhǎng)的，提示它在感染過程中起重要作用。gB 以寡聚體形式存在于病毒包膜上，并與細(xì)胞膜上氨基聚糖硫酸乙酰肝素或硫酸軟骨素結(jié)合，使病毒吸附于宿主細(xì)胞膜上，介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合、病毒穿入和胞間擴(kuò)散，引發(fā)病毒循環(huán)復(fù)制過程。gB 是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)，也是HSV-2特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的主要靶標(biāo)。gB 表達(dá)缺失必定影響病毒吸附和穿入細(xì)胞，從而抑制HSV-2的感染。UL29 基因編碼合成的ICP8 蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控病毒DNA 復(fù)制和γ 基因的表達(dá)。研究表明，該蛋白是病毒復(fù)制所必須的，一旦發(fā)生突變則可影響晚期基因的表達(dá)和DNA 的合成。該蛋白主要作用是結(jié)合病毒RNA 從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，抑制pre-mRNA 的剪切等。

本研究利用RNA 干擾技術(shù)，針對(duì)HSV-2 UL27、UL29 基因分別設(shè)計(jì)、合成8 對(duì)寡核苷酸，采用基因重組技術(shù)構(gòu)建shRNA 表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后表達(dá)siRNA，再接種HSV-2。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)UL27、UL29 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，分析shRNA 表達(dá)載體對(duì)UL27 和UL29 基因的抑制效果。篩選出干擾效率高的表達(dá)載體，進(jìn)行聯(lián)合干擾試驗(yàn)，用終點(diǎn)滴定法檢測(cè)干擾后的子代病毒滴度；用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)水平。旨在為進(jìn)一步研究通過RNAi 手段抑制HSV-2 的關(guān)鍵基因的表達(dá)治療HSV-2 提供試驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293 細(xì) 胞、大 腸 桿 菌DH5α 由 遵 義 醫(yī) 學(xué)院珠海校區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室提供；HSV-2 333 標(biāo)準(zhǔn)株來源于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）；質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo 全長(zhǎng)5 117 bp，購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶BamH I、Bbs I、Pst I 購(gòu)自美國(guó)Fermentas，T4 DNA 連接酶購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)研究所，RNA 提取試劑RNAisoTMPlus、SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit 購(gòu)自寶生物工程（中國(guó)大連）有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO，新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購(gòu)自Invitrogen 公司，鼠抗gB、ICP8 單抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 從GenBank 上獲得HSV-2（NC_001798）UL27 和UL29 基因序列，利用Invitrongen 公司的shRNA 在線設(shè)計(jì)軟件，進(jìn)行靶序列的初篩。用Blast 檢索將初篩的靶序列與其他人類基因組進(jìn)行比對(duì)，通過RNA structure 5.0 軟件對(duì)靶mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，篩選出4 條特異性序列作為靶序列，同時(shí)在試驗(yàn)中設(shè)計(jì)不針對(duì)任何基因的序列為陰性對(duì)照（Negative control，NC），見表1。

表1 篩選的HSV-2UL27、UL29 靶序列

表1 中 DNA 序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成，將寡核苷酸鏈退火形成shRNA 模板雙鏈，通過T4 連接酶連接到pGPU6/GFP/Neo 上，形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)重組載體，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用Pst I、BamH I進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞在10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293 細(xì)胞以4×104-5×104個(gè)/孔接種于24 孔板，待細(xì)胞豐度到80%時(shí)，用100 μL 質(zhì)粒/lipofectamin2000 復(fù)合物加到含有細(xì)胞24 孔培養(yǎng)板的孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后；試驗(yàn)分為4 組：空白組（空載體）、陰性對(duì)照組（shRNA NC）、對(duì)照組（shRNAGAPDH）、各干擾組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，分別于12、24、36 和48 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)情況，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算含有熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

轉(zhuǎn)染效率（%）=熒光細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%

1.2.3 HSV-2 感染HEK293 細(xì)胞 HSV-2 接種HEK-293 細(xì)胞，用2%病毒維持液培養(yǎng)病毒，反復(fù)凍融法收獲子代病毒。采用終點(diǎn)滴定法測(cè)定病毒滴度。按Reed-Muench 法計(jì)算，能引起50%細(xì)胞發(fā)生病變的病毒最高稀釋度（50% tissue culture infective dose，TCID50），即病毒滴度。各試驗(yàn)組在37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，再接種TCID50病毒。1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)UL27 基因的轉(zhuǎn)錄水平 病毒感染48 h 后，抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用SYBRGreen I 檢測(cè)。以GAPDH 作為內(nèi)參檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平，引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下：內(nèi)參GAPDH 上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；UL27 上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，62℃ 30 s，70℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以每孔GAPDH 的定量作為標(biāo)準(zhǔn)，分別校正各孔UL27 基因表達(dá)的差異，各組表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種HSV-2 48 h 后，收集細(xì)胞，提取蛋白。采用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。后者在含5%脫脂奶粉的PBST 中37℃封閉90 min，加入一抗4℃孵育過夜；PBST 充分漂洗（10 min×3 次），加入二抗37℃作用40 min；PBST 充分漂洗（10 min×3 次）；化學(xué)熒光法（ECL）顯色，以GADPH 蛋白為內(nèi)參照，曝光獲取圖像，比較各組蛋白表達(dá)量。

1.2.6 子代病毒滴定及MTT 法測(cè)定293 細(xì)胞存活率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 并感染病毒后，使用終點(diǎn)滴定法，對(duì)上述收集的子代病毒液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，采用MTT 法，對(duì)細(xì)胞的存活率進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。P<0.05 表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鑒定結(jié)果

shRNA 模板成功插入到質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo 上時(shí)，原質(zhì)粒上的Pst I 酶切位點(diǎn)被置換消失。如果構(gòu)建成功，則pGPU6/GFP/Neo-shRNA 可以被BamH I切開，而不能被Pst I 切開。Pst I 酶切結(jié)果顯示有兩條帶，分別為超螺旋的SC 構(gòu)型和質(zhì)粒的松弛開環(huán)OC 構(gòu)型，這兩條帶可以證明重組質(zhì)粒不能被Pst I 酶切。重組體被BamH I 單酶切而線性化，條帶在5 100 bp 左右（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒的Pst Ⅰ和BamH Ⅰ酶切電泳圖譜

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，GFP 的表達(dá)達(dá)到高峰。流式細(xì)胞儀測(cè)得轉(zhuǎn)染后12、24 和48 h 含有熒光的細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)的百分比分別為22.5%、37.5%和80%（圖2，圖3）?？梢娹D(zhuǎn)染48 h 后，轉(zhuǎn)染效率最好。

圖2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 圖像（100×）

2.3 HSV-2病毒滴度測(cè)定

通過終點(diǎn)滴定法測(cè)定HSV-2 病毒TCID50，以確定感染細(xì)胞所需的病毒量。計(jì)算結(jié)果顯示，TCID50為10-3.5/100 μL。表2 顯示，能使50%細(xì)胞出現(xiàn)病變的稀釋度在10-3與10-4之間。

圖3 流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率

表2 HSV-2 病毒滴度滴定結(jié)果

2.4 HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

各組shRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并感染HSV-2 48 h 后，以正常細(xì)胞空白組、陰性對(duì)照組（shRNA NC）為參照，觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果（圖4）顯示，接種24 h 后，可見陰性組多數(shù)細(xì)胞融合為多核巨細(xì)胞。接種48 h后，大部分細(xì)胞脫落，多核巨細(xì)胞裂解為細(xì)胞碎片。以正常細(xì)胞為對(duì)照，干擾組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect，CPE）。

圖4 各組HEK293 細(xì)胞的CPE（100×）

2.5 shRNA表達(dá)載體對(duì)UL27、UL29mRNA各組的抑制效果

接種HSV-2 48 h 后，用熒光定量PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)HSV-2 mRNA 的表達(dá)量。圖5 顯示在單干擾組中UL27 shRNA75 對(duì)UL27mRNA 的抑制率最高，為75.17%，UL29 shRNA1461 對(duì)UL29mRNA 的抑制率最高，為66.08%。

2.6 UL27、UL29聯(lián)合干擾表達(dá)載體對(duì)mRNA的抑制效果

聯(lián)合干擾組接種HSV-2 48 h 后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞mRNA。結(jié)果（表3）顯示，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合組對(duì)UL27 基因表達(dá)的CT 值為30.16±0.11，對(duì)UL29 基因表達(dá)的CT 值為28.72±0.24，聯(lián)合干擾組與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P<0.05）；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，無顯著性差異（P>0.05）。

圖5 shRNA 表達(dá)載體對(duì)UL27、UL29mRNA 的抑制效率

表3 shRNA 聯(lián)合表達(dá)載體對(duì)mRNA 的抑制效果

2.7 終點(diǎn)滴定法測(cè)定子代病毒滴度

HEK293 各組細(xì)胞接種HSV-2 48 h 后，收集子代病毒液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，病毒滴度用TCID50計(jì)算。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，干擾組（UL29 shRNA939 和UL29 shRNA1653）病毒滴度有下降，但未有顯著性差異（P>0.05）；其余各干擾組病毒滴度均有不同程度下降，有極顯著性差異（P<0.01）。

表4 轉(zhuǎn)染后各組的病毒滴度測(cè)定

2.8 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)HSV-2蛋白表達(dá)效果的影響

各轉(zhuǎn)染組接種病毒48 h 后，分別收集細(xì)胞提取蛋白，然后經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)印后，加入gB 抗體和ICP8 抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，其中UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合干擾組與單干擾組相比，蛋白表達(dá)量明顯減少（P<0.05）（圖6）。

2.9 MTT法檢測(cè)293細(xì)胞存活率

各轉(zhuǎn)染組接種病毒48 h 后，棄上清加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀下讀取吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果（圖7）顯示，聯(lián)合干擾組UL27 shRNA75+ UL29 shRNA1461 的細(xì)胞存活率最高。

3 討論

近年來，對(duì)RNAi 的研究現(xiàn)狀分析，在哺乳類動(dòng)物中，RNAi 并不能完全阻斷基因的表達(dá)，對(duì)阻斷基因的mRNA 水平表達(dá)量有一定的限度［17］，siRNA 在 細(xì) 胞 內(nèi) 與RISCs（RNA-induced silencing complexes）結(jié)合后，通過其識(shí)別并沉默相應(yīng)的mRNA，RISCs 有一定的飽和度，過多的siRNA 反而可能抑制其活性，也不可能無限增大siRNA 的濃度。因此將兩種基因或者多個(gè)基因的分子靶向治療相結(jié)合正成為日益活躍的研究領(lǐng)域。其原因有：其一，由于病毒感染是一個(gè)多因素、多階段、多基因參與的復(fù)雜過程，病毒對(duì)不同的基因治療的敏感性有差異，單一的基因治療往往不能取得良好的療效，隨著病毒的突變，可能在一定程度上抵消其作用，聯(lián)合基因治療有望提高療效。其二，采取不同的治療途徑，利用各個(gè)基因治療的優(yōu)點(diǎn)，提高治療效果，降低對(duì)機(jī)體正常組織的副作用。

因此本試驗(yàn)針對(duì)HSV-2 UL27 和UL29 基因各篩選出的4 條靶序列構(gòu)建特異性shRNA 質(zhì)粒表達(dá)載體，在體外細(xì)胞水平上觀察研究RNAi 對(duì)HSV-2 的抑制效應(yīng)以及二者聯(lián)合干擾對(duì)HSV-2 的抑制效應(yīng)。試驗(yàn)中UL27、UL29 各篩選出的4 條靶序列的沉默效果各有差異，其中在mRNA 水平上的單干擾組中UL27 shRNA75 組對(duì)UL27 基因mRNA 的抑制率為75.17%，UL29 shRNA1461 組對(duì)UL29 基因mRNA 抑制率為66.08%，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461聯(lián)合干擾組對(duì)UL27 基因抑制率約為91.28%，UL29基因表達(dá)抑制率約為80.40%，并用Western blotting 技術(shù)在蛋白水平上得到驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從子代的病毒滴度的變化、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞的存活率等方面檢測(cè)pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重組表達(dá)載體對(duì)HSV-2 復(fù)制的影響。經(jīng)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組及各單干擾組的比較說明，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合干擾組的子代病毒滴度最低，細(xì)胞的存活率也更高，說明其能更好地抑制HSV-2 的復(fù)制。

由此可見，HSV-2 UL27 基因在病毒感染階段起關(guān)鍵作用，而UL29 基因都在病毒復(fù)制過程中起重要作用，因此聯(lián)合干擾二者的合成，對(duì)阻止HSV-2病毒吸附和穿入以及干擾病毒DNA 合成復(fù)制，從而抑制HSV-2 病毒的感染與復(fù)制。本試驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合靶向干擾效果優(yōu)于各自的單個(gè)干擾，顯示兩個(gè)基因之間具有相互協(xié)同效應(yīng)，能夠相互聯(lián)合增強(qiáng)對(duì)單一基因的抑制。HSV-2 復(fù)制循環(huán)包括吸附、穿入、脫衣殼、DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、核衣殼組裝和病毒釋放等順序過程?？赡苋笔Я薵B 的病毒就喪失了感染的能力，導(dǎo)致之后整體的HSV-2的DNA 復(fù)制就下降了。基于基因之間的相互聯(lián)系和作用，導(dǎo)致相應(yīng)的單鏈DNA 結(jié)合蛋白也會(huì)減少，從而進(jìn)一步抑制HSV-2 DNA 的復(fù)制。提示聯(lián)合靶向特異性shRNA可能從不同途徑阻止HSV-2感染和復(fù)制，還可能減少shRNA 抗病毒感染過程中出現(xiàn)病毒變異株的概率。

圖6 Westernblot 檢測(cè)gB 和ICP8 蛋白的表達(dá)結(jié)果

圖7 MTT 法測(cè)定293 細(xì)胞存活率

HSV-2 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖由多種病毒蛋白和宿主蛋白之間的協(xié)同作用所決定，因此可以進(jìn)一步研究針對(duì)不同的病毒關(guān)鍵基因，如ICP4、UL54、US3 等進(jìn)行多個(gè)靶點(diǎn)shRNA 的設(shè)計(jì)，亦可將UL27 和UL29 的特異性siRNA 構(gòu)建于同一個(gè)shRNA重組表達(dá)載體，或者同一基因的兩個(gè)特異性siRNA構(gòu)建于同一個(gè)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，這些方法可能會(huì)產(chǎn)生更高效的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建并篩選了有效抑制病毒復(fù)制的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重 組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，可以降低子代的病毒滴度、抑制UL27、UL29 基因的mRNA 和蛋白的表達(dá)，提高細(xì)胞的存活率。

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