劉生財(cái)，匡華琴，謝禮洋，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

莧菜試管苗amaNACA2-like基因克隆及生物信息學(xué)分析

劉生財(cái)，匡華琴，謝禮洋，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

以莧菜試管苗為材料，采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)進(jìn)行amaNACA-2 like基因全長cDNA序列克隆，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，莧菜amaNACA-2 like基因cDNA全長為896 bp，其中5'UTR 66 bp，3'UTR 216 bp，poly A尾長17 bp，并包含一個(gè)615 bp開放閱讀框，編碼205個(gè)氨基酸。GenBank登錄號為KC588966。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白是一種親水性細(xì)胞質(zhì)蛋白，包括10個(gè)磷酸化位點(diǎn)和8個(gè)功能位點(diǎn)；該蛋白屬于NAC蛋白超級家族（NAC superfamily），包含NAC功能位點(diǎn)，同時(shí)包括一段UBA超家族結(jié)構(gòu)域；其二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、延伸鏈和β轉(zhuǎn)折組成；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明莧菜amaNACA2-like蛋白獨(dú)立形成一個(gè)分支，但與其他物種間親緣關(guān)系較近，說明NACA 2-like蛋白在生物進(jìn)化過程中比較保守。研究amaNACA-2 like基因克隆和生物信息學(xué)分析，可為深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

莧菜；試管苗；amaNACA-2 like；克?。簧镄畔W(xué)

核糖體是細(xì)胞質(zhì)中不同環(huán)境條件下合成多肽的分子機(jī)器，核糖體上新合成的多肽與新生多肽關(guān)聯(lián)復(fù)合體（Nascent polypeptide associated complex，NAC）結(jié)合可保護(hù)新合成的蛋白質(zhì)不與不適宜的細(xì)胞質(zhì)因素相互作用[1-3]，NAC可直接和信號識別粒子（Signal recognition particle，SRP）互作保證新合成的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，阻止非分泌蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)[4-5]，這表明NAC在保證蛋白質(zhì)準(zhǔn)確運(yùn)轉(zhuǎn)，維持生命正常活動中起重要作用[6]。NAC是一個(gè)由α和β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，是在高等真核生物中鑒定的新生多肽鏈的核糖體關(guān)聯(lián)因子[2,7]。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞分化過程中，NAC兩個(gè)亞基表達(dá)不均衡，暗示這兩個(gè)亞基有其各自功能[8-10]。α亞基具有轉(zhuǎn)錄激活及與DNA、rRNA和tRNA結(jié)合功能[11]；而β亞基可以和RNA聚合酶II型結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄起始有密切關(guān)系[12]，在植物中有廣泛研究[13-14]。有關(guān)α亞基的研究主要是在動物、微生物及人類中較多[10,15-17]，對于植物鮮有報(bào)道。

莧菜（Amaranthus tricolorL.）屬于C4一年生草本植物，離體培養(yǎng)周期短，大約60 d開花結(jié)籽，可作為研究植物生長發(fā)育的理想材料。NACA在植物生長發(fā)育過程中調(diào)控作用機(jī)制尚無報(bào)道。因此，本研究中以莧菜試管苗為試驗(yàn)材料，通過克隆nascent polypeptide-associated compleχ subunit alpha-likeprotein 2-like基因（amaNACA2-like），并對所獲得的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為探討NACA基因?qū)η{菜試管苗乃至其他植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的莧菜（Amaranthus tricolorL.syn.A.mangostanus）無菌試管苗為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 莧菜試管苗總RNA提取及質(zhì)量檢測

使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（百泰克公司）提取莧菜試管苗總RNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用超微量分光光度計(jì)（Thermo公司）測定RNA純度和濃度。

1.2.2 莧菜試管苗amaNACA2-like基因cDNA合成

采用Fermentas公司RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成保守區(qū)域及3'RACE cDNA第一鏈，采用Clontech公司Super SMARTerTMRACE cDNA Amplificaion Kit試劑盒合成5'RACE cDNA第一鏈。

1.2.3 莧菜amaNACA2-like基因引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI登陸的擬南芥、煙草、蓖麻、苜蓿、大豆等NACA基因序列比對結(jié)果，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物；3'RACE特異引物是以克隆得到的莧菜amaNACA2-like基因保守區(qū)設(shè)計(jì)兩條正向引物；5'RACE特異引物是在保守區(qū)和3'端拼接后的相對特異區(qū)域設(shè)計(jì)的2條反向引物；根據(jù)拼接得到的莧菜amaNACA2-like基因的全長設(shè)計(jì)ORF引物。委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物。本試驗(yàn)所用引物見表1。根據(jù)擴(kuò)增不同的目的片段，設(shè)定相應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序，PCR擴(kuò)增體系為25 μL。

1.2.4 目的片段的回收、克隆及測序

利用本實(shí)驗(yàn)室瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，以pMD18-T作為載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，通過菌液PCR初步驗(yàn)證陽性克隆，將菌液送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 莧菜amaNACA2-like基因序列生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 7.0進(jìn)行序列拼接及氨基酸序列推導(dǎo)；使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建不同物種間NACA的進(jìn)化樹；使用在線軟件對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜amaNACA2-like基因全長的克隆

通過對莧菜amaNACA2-like基因cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖1），得到片段大小為381 bp的保守序列，299 bp的3'端序列，383 bp的5'端序列。通過DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行序列拼接獲得全長cDNA，經(jīng)過開放閱讀框驗(yàn)證及分析，起始密碼子ATG上游-3位核苷酸為A，+4位為G，為典型的Kozak結(jié)構(gòu)，3'UTR有加尾信號“GATAA”，說明該基因?yàn)橥暾囊粭l基因（登陸號為KC588966）。經(jīng)分析顯示該基因全長為896 bp，其中5'UTR 66 bp，3' UTR 216 bp，poly A尾長17 bp，并包含一個(gè)615 bp的開放閱讀框（見圖2），編碼205個(gè)氨基酸。

表1 試驗(yàn)所用引物及其序列Table 1 Primers and sequences were used in the study

圖1 莧菜amaNACA2-like基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplification electrophoretogram ofAmaranthus tricolorL.amaNACA2-likecDNA

2.2 莧菜amaNACA2-like基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 莧菜amaNACA2-like編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測與分析

利用ProtParam對莧菜amaNACA2-like編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測與分析。結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C1157H1845N305O388S9，由3 704個(gè)原子構(gòu)成，包括242個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為26.5247 ku，理論等電點(diǎn)（pI）4.43，帶正電的氨基酸有25（Arg+Lys）個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸有49（Asp+Glu）個(gè)，總平均疏水性為-0.386，屬于親水蛋白，但不是穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)為53.26）。

2.2.2 莧菜amaNACA2-like蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測與分析

根據(jù)NCBI-CDS在線分析工具對莧菜ama-NACA 2-like蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，該蛋白屬于NAC蛋白超級家族（NAC superfamily），包含NAC功能位點(diǎn)。另通過比對預(yù)測該蛋白序列包括一段UBA超家族結(jié)構(gòu)域（見圖3），這與大豆氨基酸序列預(yù)測結(jié)果相同。

2.2.3 莧菜amaNACA2-like蛋白質(zhì)信號肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位的預(yù)測

采用在線分析工具SignaIP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對莧菜amaNACA2-like蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白沒有明顯的信號肽，說明該蛋白可能在胞質(zhì)中起作用。利用跨膜結(jié)構(gòu)分析在線分析軟件TMpred（http://vit-embnet.unil. ch/software/TMPRED-form.html），對莧菜amaNACA2-like蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明其多肽鏈上不存在由內(nèi)向外或由外向內(nèi)的螺旋，因此推測該蛋白不屬于跨膜蛋白，有可能在細(xì)胞質(zhì)中起作用。應(yīng)用PSORT對該蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，可能性為0.650。通過以上分析，推斷莧菜amaNACA2-like屬于一種胞質(zhì)蛋白。

圖2 莧菜amaNACA2-like基因cDNA全長（彩圖）Fig.2 Full-length sequence ofAmaranthus tricolorL.amaNACA2-likecDNA

圖3 NCBI中amaNACA2-like蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域檢索Fig.3 Search for conserved domain ofamaNACA2-likeprotein amino acid sequence ofAmaranthus tricolorL.by NCBI

2.2.4 莧菜amaNACA2-like蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及功能位點(diǎn)預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化作用在細(xì)胞信號傳遞過程中占有極其重要地位。利用NetPhos 2.0 Serve在線磷酸化位點(diǎn)分析工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/）對莧菜amaNACA2-like蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。從圖4中可以看出，整個(gè)多肽鏈存在10個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)（>0.5），其中絲氨酸（Ser）可能發(fā)生磷酸化的有7個(gè)，蘇氨酸（Thr）可能發(fā)生磷酸化的有2個(gè)，酪氨酸（Tyr）可能發(fā)生磷酸化的有1個(gè)?？梢钥闯?，絲氨酸磷酸化在莧菜ama-NACA 2-like蛋白中占主導(dǎo)地位，推測絲氨酸磷酸化可能在莧菜amaNACA2-like蛋白行使功能中有重要作用。

圖4 莧菜amaNACA2-like蛋白磷酸化修飾預(yù)測Fig.4 Predicted phosphorylation sites in amino acid sequence ofamaNACA2-like

蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)和相互作用位點(diǎn)的預(yù)測對于認(rèn)識蛋白質(zhì)功能機(jī)制有重大意義。通過Predict-Protein在線軟件分析（https://www.predictprotein.org// submit-basic.php）。結(jié)果表明amaNACA2-like蛋白存在3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)：SEK、SRK、TIK，3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)：SRSE、SKPD、TGVE，2個(gè)?；稽c(diǎn)：GSAEGT、GVSRSK。

2.2.5 莧菜amaNACA2-like蛋白質(zhì)卷曲以及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用Coils分析工具，對amaNACA2-like形成卷曲螺旋的傾向性進(jìn)行預(yù)測，以window=14、21和28為參數(shù)，按照幾率>50%就可形成螺旋的規(guī)則，在沒有權(quán)重和有權(quán)重情況下的分析結(jié)果一致的區(qū)段很有可能形成卷曲螺旋，3種參數(shù)及有無權(quán)重的分析結(jié)果顯示：莧菜amaNACA2-like在windows= 14時(shí)極易形成卷曲螺旋，在windows=21時(shí)可能形成卷曲螺旋，而在windows=28時(shí)不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（見圖5）。

圖5 莧菜amaNACA2-like氨基酸序列卷曲螺旋的預(yù)測Fig.5 Predicted amino acid sequence of the winded helix ofamaNACA2-like

2.2.6 莧菜amaNACA2-like蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用在線分析工具PHD（http://npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa-automat.pl?page=/NPSA/npsa-phd.html）對莧菜amaNACA2-like蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。amaNACA2-like蛋白二級結(jié)構(gòu)以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，所占比例為42.65%，其次為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)37.25%，而延伸鏈和β轉(zhuǎn)折占的比例較少，分別為13.24%和6.86%（見圖6）。

利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測該基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（見圖7）。

圖6 amaNACA2-like蛋白序列二級結(jié)構(gòu)PHD預(yù)測結(jié)果Fig.6 Secondary structure prediction by PHD foramaNACA2-like

圖7 amaNACA2-like蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Three-dimensional structure ofamaNACA2-likebasing on SWISS-MODEL

2.2.7 莧菜amaNACA2-like蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

本研究通過對莧菜amaNACA2-like基因編碼的氨基酸序列在線BLAST的結(jié)果，選取擬南芥、蓖麻、葡萄、玉米、苜蓿、煙草等其他9種植物的amaNACA2-like基因編碼的氨基酸序列，運(yùn)用MEGA 5.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ），將Bootstrap檢驗(yàn)值設(shè)置為1 000，建立其編碼區(qū)氨基酸序列之間的系統(tǒng)關(guān)系樹（見圖8）。

從圖8中可以清楚看出，莧菜amaNACA2-like蛋白獨(dú)立形成一個(gè)分支，但與其他物種間親緣關(guān)系比較近，可信度達(dá)77%，特別是擬南芥間的可信度達(dá)100%。說明NACA 2-like蛋白在生物進(jìn)化過程中比較保守。

圖8 莧菜amaNACA2-like系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree foramaNACA2-like

3 討論與結(jié)論

新生多肽關(guān)聯(lián)復(fù)合體是一個(gè)由αNAC和βNAC組成NAC的異源二聚體，可能是第一個(gè)與核糖體產(chǎn)生的新生肽鏈相結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸早期起關(guān)鍵作用[18]，保證新生鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[19]。通過對保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化樹研究分析，本研究獲得莧菜NACA基因序列。通過對NACA蛋白質(zhì)信號肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明其在細(xì)胞質(zhì)中起到作用，可能屬于細(xì)胞質(zhì)蛋白，暗示其在蛋白正確轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可能起作用，但還需進(jìn)一步研究。大量研究表明，NACA可能在動物、微生物或者人類的轉(zhuǎn)錄過程中起作用[17-20]。本研究進(jìn)行的amaNACA-2 like基因克隆和生物信息學(xué)分析可為深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis ofamaNACA2-likefromin vitro
plantlets inAmaranthus tricolorL.

LIU Shengcai,KUANG Huaqin,XIE Liyang,LAI Zhongxiong
(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002,China)

The full-lengthamaNACA2-likecDNA sequence was cloned using RT-PCR and RACE techniques and the bioinformatics was analyzed fromin vitroplantlets ofAmaranthus tricolorin this experiment.The full-length cDNA sequenceamaNACA2-likewas 896 bp in length,containing an open reading frame of 615 bp(encoding 205 animo acids),flanked by 66 bp 5'UTR and 216 bp 3'UTR that contained a 17 bp polyA.The accession number was KC588966 in GenBank.Bioinformatics analysis showed that the protein was hydrophilic cytoplasmic protein,with 10 phosphorylation sites and eight functional sites.The protein belongs to NAC superfamily with a NAC functional site.In addition,a UBA superfamily domain was contained in the sequence.The secondary structure was consisted of alphahelix,coil,strand chain and beta turn.The phylogenetic tree indicated thatamaNACA2-likeprotein constituted a branch alone,but had a close relationship with other species,which indicated NACA 2-likeprotein possesses high conservatism during species evolution.This study was helpful for further study of plantNACA2-likefunctions.

Amaranthus tricolor;in vitroplantlets;amaNACA2-like;cloning;bioinformatics

S572

A

1005-9369（2014）01-0083-07

2013-08-08

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)新教師類科研基金項(xiàng)目（20123515120009）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J05045）；福建省教育廳A類項(xiàng)目（JA12098）；福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)博士后基金項(xiàng)目（132300102）；福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院青年學(xué)術(shù)骨干培養(yǎng)基金項(xiàng)目（FAFU2012 YYPY10）

劉生財(cái)（1980-），男，講師，博士，研究方向?yàn)閳@藝植物生物技術(shù)與遺傳資源。E-mail:1215698900@qq.com

*通訊作者：賴鐘雄，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閳@藝植物生物技術(shù)與遺傳資源。E-mail:Laizx01@163.com

時(shí)間2014-1-9 20:19:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2019.006.html

劉生財(cái),匡華琴,謝禮洋,等.莧菜試管苗amaNACA2-like基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1): 83-89.

Liu Shengcai,Kuang Huaqin,Xie Liyang,et al.Cloning and bioinformatics analysis ofamaNACA2-likefromin vitroplantlets inAmaranthus tricolorL.[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):83-89.(in Chinese with English abstract)