柏錫，賈蓓，呂德康，朱延明，才華，紀(jì)巍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

水稻Os03g19020基因的克隆及亞細(xì)胞定位分析

柏錫，賈蓓，呂德康，朱延明，才華，紀(jì)巍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

Os03g19020基因是從水稻苗期冷害基因表達(dá)譜芯片中篩選到一個冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，Real-time PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，Os03g19020基因受冷誘導(dǎo)表達(dá)，響應(yīng)迅速；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Os03g19020編碼PHD-finger家族蛋白，具有典型的C4HC3保守結(jié)構(gòu)域；同源性分析結(jié)果顯示，03g19020與秈稻品種OsI-11202蛋白相似性達(dá)98%。將03g19020基因融合GFP基因，轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體細(xì)胞，結(jié)果表明，03g19020蛋白主要定位在細(xì)胞核內(nèi)。

水稻；Os03g19020基因；PHD-finger；亞細(xì)胞定位

PHD-finger結(jié)構(gòu)域是14種已知鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc-bingding motif）中的一種，是真核生物中一種進(jìn)化保守的鋅指結(jié)構(gòu)，具有典型的C4HC3（cys4-His-cys3）保守結(jié)構(gòu)域[1]。該結(jié)構(gòu)域長約50～80個氨基酸，其半胱氨酸間距相對保守[2]，在最后兩個半胱氨酸之前存在一個色氨酸或其他芳香族氨基酸殘基[3]。目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)PHD-finger類基因，它們主要參與植物發(fā)育及生長過程調(diào)控[4-7]。此外，PHD-finger類基因還參與非生物脅迫調(diào)控。劉雨等通過過量表達(dá)OsPHD1基因證明該基因可以顯著提高水稻對低溫、高鹽和干旱脅迫的耐受性[8]。水稻Os03g19020基因（PHD-finger family protein）編碼的蛋白質(zhì)屬于植物同源結(jié)構(gòu)域（Plant homeodomain，PHD結(jié)構(gòu)域）家族，前期研究中，從水稻苗期冷害基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)Os03g19020基因響應(yīng)低溫脅迫。因此，本研究將對Os03g19020基因克隆并進(jìn)行氨基酸序列分析，并對其蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，為下一步分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種采用粳稻品種空育131（Oryza sativaKongyu131），大腸桿菌（Escherichia coli）菌種為DH5α?？寺≥d體pGEM-T購自Promega公司；亞細(xì)胞定位載體為pBSK-eGFP。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

水稻種子在42℃下處理3～5 d打破休眠。5% NaClO滅菌30 min，蒸餾水清洗后浸種1 d。置于濕濾紙上，暗處30℃催芽1 d。萌動后轉(zhuǎn)移到Y(jié)oshida溶液中，28℃14 h光照（光照強(qiáng)度250 μmol·m-2·s-1），25℃10 h黑暗培養(yǎng)至三葉期。將幼苗置于4℃條件下處理，處理時間為0、1、3、6、12、24 h，取地上部組織。采用Trizol試劑（Invitrogen）提取水稻的總RNA，DNA酶Ⅰ處理后備用。以O(shè)ligod（T）18為反轉(zhuǎn)錄引物，用Super-Script III反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3 OsGAMYB基因的冷脅迫條件下的表達(dá)分析

根據(jù)ABI PRISM 7500 Sequence Detection System對實(shí)時熒光定量PCR體系的要求設(shè)計(jì)引物。以水稻cDNA為模板，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，篩選出能夠獲得銳利單峰溶解曲線的引物。用篩選出的引物對各樣品進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，每個樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。引物序列為：RT-Os03g190 20-sp:5'CAGCTCTAAGGTGGCCAGTC 3'；RTOs03g19020-asp 5'ACTGGTGTCGGAGGATCAAC 3'。以Ef1-α基因?yàn)閷φ?，引物序列為：Ef1-α sp 5'AGCCTCCTCCTCTCGCCAT 3'；Ef1-α sp:5'TGT TCATCTCAGCGGCTTC 3'。實(shí)時定量PCR體系共25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?50℃預(yù)熱2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)，3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.4 Os03g19020基因的氨基酸序列分析與同源性分析

從NCBI下載Os03g19020的蛋白同源序列，運(yùn)用Clustalx1.83及MEG 4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列進(jìn)行序列比對和進(jìn)化樹分析。

1.5 Os03g19020基因亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

根據(jù)Os03g19020基因cds區(qū)設(shè)計(jì)引物sense:5' CCATCGATATGGGGAAGGGAGGGGAAGG 3'；antisense:5'CGGGATCCGACACCTTCAGTTCCTTGGAA GTTG 3'，引物設(shè)計(jì)時應(yīng)保證Os03g19020基因與GFP融合后不發(fā)生移碼突變。PCR反應(yīng)體系為：10 μL 10×KOD plus Buffer（Mg2+free），4 μL MgCl2（25 mmol·L-1），10 μL dNTP mix（2.0 mmol·L-1each），1.5 μL 5'PCR Primer（10 μmol·L-1），1.5 μL 3'PCR Primer（10 μmol·L-1），0.4 μg水稻cDNA，2 μL KOD plus Polymerase，ddH2O補(bǔ)足體積（總體積100 μL）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，57℃退火30 s，68℃延伸90 s，共35個循環(huán)。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物構(gòu)建與表達(dá)載體pBSK-eGFP連接，轉(zhuǎn)化DH5α，利用Qiagen max plastmid extraction kit（Qiagen）制備無內(nèi)毒素質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒濃度至10 μg·μL-1。

1.6 原生質(zhì)體制備及Os03g19020基因的亞細(xì)胞定位分析

取幼嫩煙草植物葉片，切成約0.5 mm的細(xì)絲，用預(yù)質(zhì)壁分離液（組成為0.4 mol·L-1甘露醇和10 mmol·L-1氯化鈣）分離1 h，加入10 mL酶液（組成為1%的纖維素酶R10、0.25%的離析酶MR10、6.8 mmol·L-1氯化鈣、0.4 mol·L-1甘露醇，pH 5.5）于25℃對材料進(jìn)行靜置酶解2～3 h。用過濾除網(wǎng)去未完全消化的殘?jiān)?00 g離心3 min，棄上清，加入5 mL漂洗液W5（154 mmol·L-1NaCl、125 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1MES），重復(fù)3次，用1 mL MMG溶液（0.4 mol·L-1甘露醇、15 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1MES）重懸。具體方法參見文獻(xiàn)[9]。取20 μL原生質(zhì)體溶液滴加于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)原生質(zhì)體數(shù)，并換算成每克鮮組織所分離的原生質(zhì)體數(shù)，最終調(diào)整濃度為105個·mL-1。PEG法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，將100 μL原生質(zhì)體溶液、10 μL質(zhì)粒與110 μL 50%PEG溶液混勻后靜置30 min，W5溶液清洗3次，25℃對材料進(jìn)行靜置恢復(fù)，16 h后觀察。激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，GFP的激發(fā)波長為488 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫下Os03g19020基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

粳稻品種空育131幼苗經(jīng)4℃冷處理0、1、3、6、12和24 h后，總RNA提取結(jié)果見圖1，Real-time PCR分析Os03g19020在冷脅迫條件下表達(dá)結(jié)果見圖2。

圖1 總RNA變性凝膠電泳檢測Fig.1 Total RNA examined on formaldehyde agarose gel

圖2 Real-time PCR分析Os03g19020在冷脅迫條件下表達(dá)Fig.2 Expression of Os03g19020 under cold stress by Real-time PCR

由圖1可見，從左至右依次為冷脅迫處理0、1、3、6、12、24 h的變性凝膠電泳檢測結(jié)果，在28S和18S區(qū)域有明顯條帶，亮度比例接近2∶1，初步判斷其完整性良好，可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，用于下步Real-time PCR分析。三葉期水稻經(jīng)冷處理時，Os03g19020基因隨著處理時間的增加，表達(dá)量逐漸增加，12 h達(dá)到最高峰，以后又有下降趨勢（見圖2），說明Os03g19020是冷脅迫早期應(yīng)答基因。

2.2 Os03g19020的氨基酸序列分析與同源性分析

在NCBI網(wǎng)站上以O(shè)s03g19020為靶序列進(jìn)行BlastP比對，下載比對結(jié)果中與Os03g19020相似度高的基因蛋白序列，用Clustal X進(jìn)行蛋白的多重序列比對，并用MEG4構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3A所示。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，與Os03g19020相似的蛋白來自多個物種，其中與Os03g19020相似性最高的是秈稻品種OsI-11202蛋白。OsI-11202被推斷為是一種PHD finger蛋白。另外，利用Clustal X進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果由圖3B所示，PHD finger家族蛋白都含有典型的C4HC3（cys4-His-cys3）保守結(jié)構(gòu)域，并且最后兩個半胱氨酸之前存在一個色氨酸。

圖3 Os03g19020與其他PHD finger蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of OsMYB17 with other PHD finger proteins and phylogenetic tree analysis

2.3 Os03g19020基因的克隆與亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

為研究Os03g19020分子功能，根據(jù)Os03g19020序列設(shè)計(jì)引物，以水稻cDNA為模板，擴(kuò)增并克隆到終止密碼子突變的CDS序列，長2 397 bp。將Os03g19020基因CDS片段連接到pBSK-eGFP載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取PCR鑒定為陽性克?。ńY(jié)果未顯示）的質(zhì)粒，用ClaⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切片段在2 000 bp（見圖4）。經(jīng)測序證明，插入沒引起讀碼框變化，表明載體構(gòu)建成功，Os03g19020 CDS片段已經(jīng)連接到亞細(xì)胞定位載體pBSK-eGFP上。

圖4 Os03g19020亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of protein sub-cellular location vectors for Os03g19020

2.4 Os03g19020蛋白的亞細(xì)胞定位分析

利用PEG法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染煙草原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。在轉(zhuǎn)Os03g19020+GFP基因的原生質(zhì)體中，綠色熒光出現(xiàn)在細(xì)胞核中，而細(xì)胞質(zhì)和其他部位沒有看到GFP的表達(dá)（見圖5）；在只轉(zhuǎn)GFP基因的對照中，綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，說明Os03g19020蛋白是一種核定位蛋白。

圖5 Os03g19020的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular location of Os03g19020 in protoplast

3 討論與結(jié)論

PHD-finger結(jié)構(gòu)域是真核生物中一種進(jìn)化保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，通常參與蛋白質(zhì)之間的相互作用，特別是對核小體組蛋白進(jìn)行甲基化、乙?；?、磷酸化等修飾[10]。通過識別結(jié)合組蛋白甲基化密碼，參與核內(nèi)不同的生物學(xué)進(jìn)程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、凋亡等[11]。在植物中關(guān)于PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究主要集中在擬南芥上，Thomas等發(fā)現(xiàn)VIN3和VRN5對春化作用敏感，為春化作用所需[4]；胡功鈴等認(rèn)為在春化處理過程中，VIN3及其同源基因編碼的蛋白都具有PHD-finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過對開花抑制基因FLOWERING LOCUS C染色質(zhì)組蛋白進(jìn)行H3K9、H3K27甲基化、H3K9和H3K14去乙?；刃揎?，調(diào)節(jié)FLC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，使其從松弛狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶s狀態(tài)而關(guān)閉其功能，影響FLC轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)開花[12]；Shinozaki等發(fā)現(xiàn)MS1蛋白是花粉成熟過程不可缺少的核信號分子[6]。

通過對水稻苗期脅迫處理發(fā)現(xiàn)Os03g19020基因是冷脅迫早期應(yīng)答基因，推測該基因可能對苗期水稻耐性的提高具有一定作用。通過氨基酸序列分析，Os03g19020具有典型的C4HC3結(jié)構(gòu)域，通過同源性分析，該蛋白與一些已有的PHD-finger蛋白具有很高同源性；亞細(xì)胞定位分析，Os03g19 020定位在細(xì)胞核內(nèi)。預(yù)測該基因編碼的蛋白可能與組蛋白結(jié)合，參與到核內(nèi)的生物學(xué)過程，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高植物冷脅迫耐性，為下一步研究提供依據(jù)。

在基因的功能研究過程中，基因表達(dá)產(chǎn)物的功能與其在宿主細(xì)胞中的定位有重要關(guān)系，特別是對于真核細(xì)胞，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與其功能有著密切聯(lián)系，蛋白質(zhì)在生物體細(xì)胞核糖體內(nèi)合成后，除分泌蛋白被分泌到細(xì)胞外，有些蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中，其他蛋白都要按其功能精確地定位到相應(yīng)的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)域，如細(xì)胞核、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等[13]。蛋白質(zhì)位于不同的細(xì)胞部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，對研究外源基因表達(dá)產(chǎn)物的功能或未知新基因的功能具有很重要意義。目前被廣泛應(yīng)用的能進(jìn)行亞細(xì)胞定位的報告基因主要是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。綠色熒光蛋白是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的一個重要工具，綠色熒光蛋白相對分子質(zhì)量很小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一種直觀性很強(qiáng)的遺傳標(biāo)記物[13-14]。外源基因通過與某單一序列的融合，可特異地進(jìn)行細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器定位。

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Cloning and subcellular localization analysis ofOs03g19020 gene in rice

BAI Xi,JIA Bei,LV Dekang,ZHU Yanming,CAI Hua,JI Wei
(School of Life Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Os03g19020 was identified as a cold-responsive gene based on genome profiles and Real-time PCR analysis in response to cold stress.The Os03g19020 mRNA showed rapid up-regulation following cold-stress treatment.The amino acid sequence analysis revealed that Os03g19020 encoding PHD-finger family proteins,with a typical C4HC3 conserved domain;homology analysis showed that 03g19020 was similar to indica rice OsI-11202 protein,and the serial similarity was about 98%.The subcellular localization mainly in the nucleus suggested that Os03g19020 was an transcription factor.

rice;Os03g19020 gene;PHD-finger;subcellular localization

S572

A

1005-9369（2014）01-0029-05

2012-02-28

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（2011TD005）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金（2009RC06）

柏錫（1975-），男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锟鼓娣肿由飳W(xué)。E-mail:baixi@neau.edu.cn

時間2014-1-9 20:20:34[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2020.007.html

柏錫,賈蓓,呂德康,等.水稻Os03g19020基因的克隆及亞細(xì)胞定位分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(1):29-33.

Bai Xi,Jie Bei,Lv Dekang,et al.Cloning and subcellular localization analysis ofOs03g19020 gene in rice[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):29-33.(in Chinese with English abstract)