趙雪，韓英鵬，李海燕，滕衛(wèi)麗，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

大豆主要品質(zhì)性狀資源評價及分子標(biāo)記分析

趙雪，韓英鵬，李海燕，滕衛(wèi)麗，李文濱*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

對黑龍江省92個大豆品種（系）的蛋白質(zhì)和油分含量進(jìn)行評價，應(yīng)用SSR標(biāo)記分析和發(fā)掘與蛋白質(zhì)及油分含量性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。結(jié)果表明，黑龍江大豆種質(zhì)蛋白質(zhì)和油分含量變異豐富，年際間數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定；53個SSR標(biāo)記在92個品種中檢測到121個等位變異，品種間相似度范圍12%～77%；利用親緣關(guān)系樹和蛋白質(zhì)及油分含量表型分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量分界值為44%，油分含量分界值為20%；Satt561-250與蛋白質(zhì)含量呈顯著相關(guān)，Satt428-242與油分含量呈顯著相關(guān)，該分子標(biāo)記為蛋白質(zhì)和油分性狀的資源篩選和輔助育種提供依據(jù)。

大豆；蛋白質(zhì)含量；油分含量；SSR標(biāo)記

大豆蛋白是人類食用和飼用植物蛋白的主要來源，大豆油消費又占世界植物油消費首位[1]。近年來，高蛋白和高油分的特用大豆品種選育和利用成為大豆育種者和生產(chǎn)者關(guān)注重點[2]。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇，以期在早期世代即能對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定選擇，克服隱性基因再度利用時識別困難，在提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種等方面發(fā)揮重要作用[3]。大豆蛋白質(zhì)和油分含量屬復(fù)雜數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大[4]，篩選蛋白質(zhì)及油分含量表現(xiàn)穩(wěn)定的大豆基因型和連鎖的分子標(biāo)記應(yīng)用于遺傳改良，可提高優(yōu)良資源利用效率，加速優(yōu)良品種選育的進(jìn)程。黑龍江省是中國大豆的主要產(chǎn)區(qū)，通過對黑龍江栽培大豆種質(zhì)資源蛋白質(zhì)和油分品質(zhì)進(jìn)行評價，探索黑龍江栽培大豆種質(zhì)資源主要品質(zhì)性狀的多樣性，對于優(yōu)化品質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高黑龍江主栽大豆品種在大豆總產(chǎn)中的比例具有重要作用。

本研究以黑龍江代表性大豆種質(zhì)資源為研究對象，旨在評價供試材料的遺傳多樣性及蛋白質(zhì)和油分性狀的表型變異多樣性，篩選優(yōu)異大豆種質(zhì)資源，分析目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記之間的關(guān)系，為優(yōu)質(zhì)大豆品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2011、2012年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗實習(xí)基地種植，92個黑龍江省主栽大豆品種，按小區(qū)種植，隨機(jī)排列，3次重復(fù)，6行區(qū)，行長6 m，行距0.70 m，株距0.05 m，管理同生產(chǎn)田。品種材料的名稱和來源見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆種子蛋白質(zhì)含量測定

選擇粒圓、飽滿、無蟲食的大豆籽粒，采用近紅外谷物分析儀（Foss1241，瑞典）進(jìn)行蛋白質(zhì)和油分含量測定。

1.2.2 大豆基因組DNA提取及分子標(biāo)記分析

采集供試品種健康葉片保存于超低溫冰箱中備用，基因組DNA提取采用CTAB法[5]，方法略有改動。選取10份大豆種質(zhì)DNA對600個SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇PCR產(chǎn)物單一且在品種間多態(tài)性良好的SSR標(biāo)記引物進(jìn)行全部供試種質(zhì)資源的基因分型。SSR標(biāo)記引物根據(jù)SoyBase網(wǎng)址（http://www.soybase.org）提供的序列，由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積16 μL，包括2.4 μL DNA，1.6 μL PCR buffer，1.2 μL MgCl2（25 mmol·L-1），0.24 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），0.24 μLTagDNA聚合酶（5 U·μL-1），4 μL正反向混合引物（4 μmol·L-1）以及6.32 μL去離子水。PCR產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用數(shù)字1和0分別表示供試材料某一等位位點的有無，有記為“1”，無記為“0”，建立0和1數(shù)據(jù)庫。SSR位點的等位變異數(shù)和多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）按如下公式計算：PIC=1-∑Pi2，式中，Pi是群體中含有第i個等位位點的比例[6]。用NTsys 2.10e軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)估計，利用非加權(quán)類平均法UPGMA（Unweight pairgroup method using arithmetic averages）對所有供試種質(zhì)建立樹狀圖。對0，1矩陣進(jìn)行聚類分析，建立樹狀圖[7]，采用Li等報道的統(tǒng)計方法進(jìn)行基因型與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析和差異評價[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白質(zhì)和油分含量的統(tǒng)計與分析

2011年和2012年供試材料種子蛋白質(zhì)和油分含量分布如圖1所示，黑龍江主栽大豆品種蛋白質(zhì)含量總體以43%～45%居多，分布于這個區(qū)間的樣本數(shù)兩年均值占總數(shù)55.4%，蛋白質(zhì)含量在42%以下和在46%以上的為少數(shù)，分別占總數(shù)的11.9%、4.34%。油分含量總體以19%～21%居多，占總數(shù)的70.6%，油分含量在19%以下和在22%以上的為少數(shù)，分別占總數(shù)的14.1%、3.26%。

黑龍江主栽大豆品種蛋白質(zhì)含量變化范圍為40.78～47.03，變異系數(shù)為0.03，最大值為47.06，最小值為40.74。由表2可知：黑龍江主栽大豆品種油分含量變化范圍為17.10～28.14，變異系數(shù)為0.066，最大值為28.14，最小值為17.10。通過表型分析說明黑龍江大豆種質(zhì)蛋白質(zhì)和油分含量在表型上存在豐富的變異，且同一地點的年際間數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定。

表1 材料名稱及來源Table 1 Variety name and origin

圖1 2011年和2012年供試品種蛋白質(zhì)和油分含量的分布Fig.1 Distribution of oil and protein content of tested soybean varieties in 2011 and 2012

表2 大豆蛋白和油分含量的統(tǒng)計分析Table 2 Analysis of protein and oil content in soybean varieties

2.2 蛋白質(zhì)和油分含量與SSR標(biāo)記基因型的相關(guān)分析

所篩選的600個SSR標(biāo)記中的53個在測試材料中表現(xiàn)為多態(tài)性，PCR產(chǎn)物單一且條帶清晰。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)53個SSR位點共檢測到121個等位變異，平均等位變異數(shù)為每個位點2.28個，多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.112～0.795。所有位點中大部分等位變異數(shù)為2個，Satt518、Satt314和Satt114等15個標(biāo)記位點檢測3個以上的等位變異。53個位點等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量見表3。

依據(jù)SSR標(biāo)記基因型矩陣構(gòu)建92份供試材料的親緣關(guān)系樹圖（見圖2）。供試材料相似性系數(shù)范圍為12%～77%，表明材料之間的親緣關(guān)系較為接近。親緣關(guān)系與蛋白質(zhì)及油分表型聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)（如圖2虛線指示），蛋白質(zhì)含量大于44%和小于44%的大豆品種（系）分別表現(xiàn)為成簇分布；同時油分含量在20%這一臨界值處在親緣關(guān)系樹上大致被分為兩大類。

表3 SSR標(biāo)記位點等位變異數(shù)及多態(tài)性信息含量Table 3 Number of allelic variations and PIC value of SSR markers

續(xù)表

圖2 大豆種質(zhì)資源油分（左）和蛋白質(zhì)（右）的表型多樣性聚類分析Fig.2 Cluster analysis of oil（left）and protein（right）content for tested accessions

進(jìn)一步利用t測驗對分子標(biāo)記基因型與目標(biāo)性狀表型值進(jìn)行方差分析，共獲得2個分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)（見表4）。

其中位于Gm01染色體的SSR標(biāo)記Satt561，其長度為250 bp等位變異與蛋白質(zhì)含量低值表型組顯著關(guān)聯(lián)，方差為-0.30。位于Gm19染色體的SSR標(biāo)記Satt428，其長度為242 bp的等位變異與油分含量的關(guān)聯(lián)達(dá)到顯著水平。

表4 與大豆蛋白和油分含量相關(guān)的SSR分子標(biāo)記Table 4 SSR markers associated with protein or oil content of soybean

3 討論

種質(zhì)資源的多樣性反映在表現(xiàn)型和基因型兩個方面，表現(xiàn)型受環(huán)境影響，其影響程度依研究性狀不同而不同，大豆蛋白質(zhì)和油分性狀是大豆重要的品質(zhì)性狀，屬于復(fù)雜數(shù)量性狀范疇，針對此類性狀進(jìn)行資源評價要依靠多年多點的試驗數(shù)據(jù)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在育種中廣泛應(yīng)用，克服針對表型選擇的缺陷，實現(xiàn)對基因型的直接選擇。本研究利用SSR標(biāo)記和蛋白質(zhì)及油分含量的聯(lián)合分析，將兩個性狀高表型值和低表型值明確分類，為兩個性狀的種質(zhì)資源分類利用提供參考。

利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)評價種質(zhì)資源已有報道，宋喜娥等報道中國栽培大豆微核心種質(zhì)遺傳多樣性平均PIC為0.743[9]，Narvel等用74個SSR引物分析39份大豆優(yōu)良品種PIC（0.50）和40份引進(jìn)種質(zhì)PIC（0.56）[10]，謝華等用4個引物僅在中國秋大豆核心種質(zhì)中檢測出等位變異數(shù)目與前者相當(dāng)[11]，但PIC（0.83）高于前者。欒維江等從3 226份東北春大豆中選擇283份種質(zhì)進(jìn)行表型性狀和SSR檢測結(jié)果表明，吉林省和遼寧省種質(zhì)遺傳多樣性表現(xiàn)較為一致，均高于黑龍江省種質(zhì)遺傳多樣性[12]。本研究結(jié)果得到的等位變異和引物平均PIC都小于國內(nèi)外研究者報道[9-12]，同類研究發(fā)現(xiàn)[9-12]，不同研究所針對的材料各有其特征，差異源于種質(zhì)資源區(qū)域代表性，群體大小，分子標(biāo)記類型以及標(biāo)記數(shù)目等，故同類研究類比存在一定偏差，針對各產(chǎn)區(qū)大豆種質(zhì)資源建立區(qū)域代表性核心種質(zhì)庫以及育成品種明確的系譜關(guān)系對整合個性化研究結(jié)果和種質(zhì)資源的有效利用尤為重要。

本研究通過分子標(biāo)記與表型關(guān)聯(lián)性分析各獲得一個與蛋白質(zhì)和油分含量相關(guān)聯(lián)的等位變異，其中控制蛋白質(zhì)含量的Satt561被報道與粒重性狀連鎖[13]，Hyten等發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與控制大豆生殖生長的性狀有關(guān)[14]；而控制油分含量的Satt428被報道與豆莢重量關(guān)聯(lián)[15]，蛋白質(zhì)和油分是大豆籽粒的主要成分，且在生殖生長階段于籽粒中積累，因此可以推斷本研究與已知位點存在一定重疊。所檢測到等位變異對輔助選擇籽粒蛋白油分含量貢獻(xiàn)需進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究利用SSR標(biāo)記評價黑龍江大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)供試材料親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，但從種子蛋白質(zhì)和油分含量性狀的表型分布來看，仍存在較廣泛的遺傳變異，因此在今后的研究工作中，對現(xiàn)有資源的高效利用和新變異引進(jìn)非常重要。Satt561-250與蛋白質(zhì)含量大于44%的黑龍江主栽大豆品種呈顯著相關(guān)，Satt428-242與油分含量大于20%的黑龍江主栽大豆品種呈顯著相關(guān)，上述等位變異可用于指導(dǎo)高蛋白和高油分含量大豆品種的分子輔助選擇育種。

[1]朱志華,李為喜,劉三才,等.2002年我國大豆（Glycine max）品種及種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)和脂肪含量分析[J].植物遺傳資源學(xué)報,2003,4(2):157-161.

[2]何志鴻,何雪瑩.黑龍江省大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向與策略[J].大豆通報,2006(4):1-3.

[3]李文濱,趙雪.2009年大豆分子標(biāo)記及輔助選擇育種研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(1):139-148.

[4]Miller J E,Fehr W R.Direct and indirect recurrent selection for protein in soybeans[J].Crop Science,1979,19:101-106.

[5]Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem Bull,1987,19:11-15.

[6]Shete S,Tiwari H,Elston R C.On estimating the heterozygosity and polymorphism information content value[J].Theoretical Population Biology,2000,57(3):265-271.

[7]Rohlf F J.NTSYS-pc:Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.2[CP/DK].NewYork:Exeter Publishing Ltd,2005.

[8]Li W B,Han Y P,Zhang D,et al.Genetic diversity in soybean genotypes from north-eastern China and identification of candidate markers associated with maturity rating[J].Plant Breeding, 2008,127:494-500.

[9]宋喜娥,李英慧,常汝鎮(zhèn),等.中國栽培大豆(Glycine max(L.) Merr.)微核心種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010,43(11):2209-2219.

[10]Narvel J M,Fehr W R,Chu W C,et al.Simple sequence repeat diversity among soybean plant introductions and elite genotypes [J].Crop Sci,2000,40(5):1452-1458.

[11]謝華,常汝鎮(zhèn),曹永生,等.利用中國秋大豆(Glycine max(L.) Merr)篩選SSR核心位點的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(4): 360-366.

[12]欒維江,劉章雄,關(guān)榮霞,等.東北春大豆樣本的代表性及其SSR位點的遺傳多樣性分析[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2005,16(8):1469-1476.

[13]Guo G Y,Rui S,Meng H,et al.Quantitative trait locus(QTL) analysis of pod related traits in different environments in soybean [J].Afric J Biotech,2011,10(56):11848-11854.

[14]Hyten D L,Pantalone V R,Saxton A M,et al.Molecular mapping and identification of soybean fatty acid modifier quantitative trait loci[J].J Am Oil Chem Soc,2004,81(12):1115-1118.

[15]Cheng L,Wang Y,Zhang C,et al.Genetic analysis and QTL detection of reproductive period and post-flowering photoperiod responses in soybean[J].Theor Appl Genet,2011,123:421-429.

Evaluation and molecular marker analysis of soybean germplasm in main quality traits

ZHAO Xue,HAN Yingpeng,LI Haiyan,TENG Weili,LI Wenbin(Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education(Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding/Genetics of Chinese Agriculture Ministry),Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

In this study,a total of 92 soybean cultivars or lines from Heilongjiang Province were used to evaluate the seed protein and oil contents in 2011 and 2012.SSR molecular markers were used to analyze genetic relationship of the tested soybean accessions and detect allelic variation associated with the two target traits.The results showed that the protein and oil contents of tested accessions were relative stable in different years.A total of 121 allelic variations were identified in 53 SSR markers.The similarity of accessions was ranged from 12%to 77%indicating that the relationship between these accessions was near.The total samples were divided into two groups by the critical value(44%)for protein content and(20%)for oil content.The allele that Satt564-250 was found to associate with protein content and Satt428-242 was found to associate with oil content.These markers will be useful for germplasm identification of high protein and oil content and for molecular assisted breeding for soybean quality traits.

soybean;protein content;oil content;SSR marker

S326；S565.1

A

1005-9369（2014）05-0001-07

2013-03-11

國家“十二五”科技支撐計劃（2011BAD35B06-1）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-04-PS04）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃“973計劃”前期項目（2012CB126311）；國家自然基金項目（31201227，31301339）；中國博士后項目（20110491024）；黑龍江省博士后項目（LBH11220，LBH-TZ1210）；黑龍江省教育廳骨干教師項目的資助項目（1252G014）；黑龍江省教育廳新世紀(jì)項目優(yōu)秀人才資助項目（1253-NCET-005）；教育部博士點項目（20122325120012）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后啟動金項目資助（2012RCB11）

趙雪（1983-），女，助理研究員，博士，研究方向為大豆遺傳育種。E-mail:zhaoxue_s@163.com

*通訊作者：李文濱，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為大豆遺傳育種。E-mail:wenbinli@neau.edu.cn

時間2014-5-12 8:58:59[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0859.004.html

趙雪,韓英鵬,李海燕,等.大豆主要品質(zhì)性狀資源評價及分子標(biāo)記分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(5):1-7.

Zhao Xue,Han Yingpeng,Li Haiyan,et al.Evaluation and molecular marker analysis of soybean germplasm in main quality traits[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):1-7.(in Chinese with English abstract)