黃友和, 楊尚彤, 周志強(qiáng), 熊 娟, 陳 洪, 劉玉姮, 姜興濤,*

(1.波頓(上海)香料科技有限公司,上海 201201;2.深圳波頓香料有限公司,廣東深圳 518051)

植物和微生物合成2-苯乙醇的研究進(jìn)展

黃友和1, 楊尚彤1, 周志強(qiáng)1, 熊 娟1, 陳 洪1, 劉玉姮2, 姜興濤2,*

(1.波頓(上海)香料科技有限公司,上海 201201;2.深圳波頓香料有限公司,廣東深圳 518051)

2-苯乙醇是一種有廣泛用途的香味物質(zhì),對其他香味在食品、煙草和化妝品等日化產(chǎn)品有增效作用.介紹了目前2-苯乙醇在植物和微生物中的代謝機(jī)理和最新研究進(jìn)展,并對其研究前景進(jìn)行了展望.

2-苯乙醇;植物;微生物

2-苯乙醇是一種具有類似玫瑰花香的揮發(fā)性無色液體.自然界中2-苯乙醇主要存在于裸子植物和被子植物及其提取的精油中.全球2-苯乙醇年產(chǎn)量近萬噸,基本采用化學(xué)合成法生產(chǎn).2011年Hua Dongliang等[1]提到化學(xué)合成的2-苯乙醇國際市場價格為5美元/kg,近期未見關(guān)于天然2-苯乙醇的市場價格的報道,2002年其價格已高達(dá)1 000美元/kg以上.單純的植物提取法已無法滿足人們對天然2-苯乙醇的需求,研究合成2-苯乙醇產(chǎn)量較高的植物及微生物的代謝機(jī)理,提高2-苯乙醇的產(chǎn)量已經(jīng)成為研究熱點(diǎn).

1 植物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的研究現(xiàn)狀

目前對植物中2-苯乙醇合成機(jī)制的研究尚處于起步階段,且主要集中在美國、日本等國家.

1.1 2-苯乙醇在番茄中的合成途徑研究

Tieman等[2]通過同位素示蹤法(即用13C標(biāo)記苯丙氨酸)確定了在番茄中2-苯乙醇的合成途徑:首先,AADC(芳香族氨基酸脫羧酶)催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯乙胺;其次,MAO(單胺氧化酶)催化苯乙胺生成苯乙醛;最后,經(jīng)PAR(苯乙醛還原酶)催化轉(zhuǎn)化為2-苯乙醇.在整個反應(yīng)過程中,關(guān)鍵酶包括AADC、MAO和PAR.Tieman等[3]又確定了番茄里的兩種酶:LePAR1和LePAR2.他們將這兩種酶的cDNA分別在矮牽牛花中構(gòu)建表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后的矮牽?；ㄖ?-苯乙醇的含量都有明顯地提高.

1.2 2-苯乙醇在玫瑰中的合成途徑研究

Sakai等[4]發(fā)現(xiàn)在玫瑰花中由L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇有兩個關(guān)鍵酶:依賴 5-磷酸吡哆醛的AADC和PAR.AADC催化L-苯丙氨酸合成苯乙醛是催化D-苯丙氨酸的9倍,PAR對多種揮發(fā)性醛類物質(zhì)有專一性.在有氧的情況下,AADC在水解L-苯丙氨酸后,經(jīng)過脫羧和氧化,生成了苯乙醛和NH3,而后苯乙醛由PAR催化轉(zhuǎn)化生成2-苯乙醇,NADPH(還原型輔酶Ⅱ)和NADH(還原型輔酶Ⅰ)都能在玫瑰中做PAR的輔助因子.

Chen Xiaomin等[5]對突厥薔薇細(xì)胞內(nèi)純化的rose-PAR和通過cDNA從大腸桿菌表達(dá)的重組PAR做詳細(xì)的研究,包括分子特性、專一性和對輔助因子的偏好性.結(jié)果推斷出來的重組氨基酸序列分別與番茄PAR1和PAR2有77%和75%相似性.花瓣中PAR含量要明顯高于花萼和葉子,在花瓣展開的時候含量最高.重組-PAR和rose-PAR在催化苯乙醛合成2-苯乙醇時更偏愛輔助因子NADPH.然而,rose-PAR對苯乙醛的催化活性是重組PAR的10 倍,且它們的最適底物也不同,其原因可能是在大腸桿菌翻譯后缺乏修飾作用.

雖然已有報道植物細(xì)胞合成2-苯乙醇是通過莽草酸途徑,并且通過同位素標(biāo)記法知道苯乙醛是合成2-苯乙醇過程中的前體和中間體,但有關(guān)植物合成2-苯乙醇的完整途徑的報道較少.Yang Ziyin 等[6]采用化學(xué)合成穩(wěn)定的[2,3,4,5,6-13C5]莽草酸為前體物質(zhì),通過同位素標(biāo)記法在離體并具有生物活性的玫瑰細(xì)胞原生質(zhì)體上,推測出從莽草酸到2-苯乙醇在玫瑰細(xì)胞中的合成路徑.

2 微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇代謝途徑的研究情況

對微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的研究早已成熟,但目前一般都是通過艾氏途徑調(diào)控2-苯乙醇的合成.艾氏途徑是L-苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成苯丙酮酸,繼而經(jīng)過脫羧酶和氧化脫氫酶作用生成2-苯乙醇[1](如圖1).

圖1 艾氏途徑轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成苯乙醇Fig.1 Ehrlich pathway for2-PE production from L-Phe

3 國內(nèi)外提高微生物產(chǎn)2-苯乙醇的方法

2-苯乙醇對微生物的毒性是制約其高產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[1],在其質(zhì)量濃度為2.0～3.0 g/L時,能抑制多種細(xì)菌及真菌的生長.為提高2-苯乙醇產(chǎn)量,

目前廣泛采用的較為有效的方法有菌種的突變篩選,發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及原位萃取技術(shù).

3.1 菌種的突變篩選、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

2008年,崔志峰等[7]通過對釀酒酵母用紫外誘變等方法進(jìn)行誘變育種,獲得了其中一株CWY132210菌株,其耐受性較原始菌株提高50%,產(chǎn)量提高了9.1%.2009年Eshkol等[8]選育出2-苯乙醇耐受性菌株,通過搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)出4.5 g/L 2-苯乙醇.2010年王航等[9]從8株釀酒酵母中初篩到一株菌株FD0419,通過誘變和原生質(zhì)體融合,最終篩得菌株R-UV3.2-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)2.51 g·L-1,比出發(fā)菌株提高69.6%.2013年Celińska等[10]第一次報道解脂耶羅維亞酵母具有產(chǎn)2-苯乙醇的能力,并且在沒有優(yōu)化培養(yǎng)基的情況下發(fā)酵 Y.lipolytica NCYC3825,產(chǎn)2-苯乙醇達(dá)2 g/L.2004年Etschmann 等[11]為提高 K.marxianus CBS 600產(chǎn)2-苯乙醇產(chǎn)量,采用遺傳算法,通過改變13種培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度,經(jīng)過98次平行實(shí)驗(yàn),最終生產(chǎn)2-苯乙醇質(zhì)量濃度為5.6 g/L,較沒優(yōu)化前提高了87.0%.2007 年Garavaglia等[12]以葡萄汁為培養(yǎng)基培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母,通過23因子設(shè)計,得出在溫度37℃,pH 值7.0,L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為3.0 g/L時,2-苯乙醇產(chǎn)率最高.2007年梅建鳳等[13]以S.cerevisiae BD為出發(fā)菌株,經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后,產(chǎn)物2-苯乙醇質(zhì)量濃度可達(dá)4.815 g/L.2011年Rong Shaofeng等[14]選取可氧化降解乙醇的活性干酵母,以L-苯丙氨酸為底物,以乙醇為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇,發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物2-苯乙醇質(zhì)量濃度可達(dá)到2.4 g/L.另外,優(yōu)化的培養(yǎng)溫度和PH值也能提高2-苯乙醇的含量.

3.2 原位萃取技術(shù)

2-苯乙醇像其他醇類物質(zhì)一樣對微生物細(xì)胞有一定的毒性,王航等[15]研究了在不同濃度2-苯乙醇作用下,釀酒酵母R-UV3生理生化特性的變化規(guī)律.結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)2-苯乙醇質(zhì)量濃度從2.4 g/L到3.0 g/L時,酵母的分解代謝能力、細(xì)胞膜滲透性、aro10基因表達(dá)水平等生理生化特性都發(fā)生較為顯著的變化.所以在生產(chǎn)2-苯乙醇過程中,須考慮2-苯乙醇的毒性,才能達(dá)到2-苯乙醇高產(chǎn)的目的.為此,國內(nèi)外研究人員采用了原位分離技術(shù).

3.2.1 有機(jī)相-水相萃取技術(shù)

早期的研究都以油醇為有機(jī)萃取劑,如Stark等[16]在2002年以油醇作萃取劑,采用兩相補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù),發(fā)酵S.cerevisiae Giv2009,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇在油醇相中的含量達(dá)24 g/L,總產(chǎn)量可達(dá)12.6 g/L.Etschmann等[17]在2006年用K.marxianus CBS600發(fā)酵2-苯乙醇,為消除終產(chǎn)物2-苯乙醇對細(xì)胞生長的毒性,在培養(yǎng)過程中用聚丙二醇1200作為提取劑,可使有機(jī)相中的2-苯乙醇產(chǎn)量提高到26.5 g/L.梅建鳳等[18]研究了生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇在水/有機(jī)溶劑兩相體系中合成工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,油酸是兩相體系的最佳萃取溶劑,但油酸可能會導(dǎo)致反應(yīng)體系的溶氧降低,所以可以考慮在加入油酸的同時,適當(dāng)?shù)脑黾芋w系中的通氧速率.同時,有機(jī)萃取有幾個缺點(diǎn):1)萃取劑如油酸的沸點(diǎn)高,在286℃(100 mm Hg),2-苯乙醇的沸點(diǎn)是220℃,在真空蒸餾時可能會發(fā)生反應(yīng);2)萃取劑的香味會影響到產(chǎn)物的香氣;3)發(fā)酵產(chǎn)生的乳化液給產(chǎn)品的分離帶來麻煩.

3.2.2 固相-水相吸附技術(shù)

雖然有機(jī)相-水相萃取技術(shù)效果明顯,但是也伴隨著黏度大、產(chǎn)品不易分離和毒性大等缺點(diǎn),因此,有人采用固相-水相吸附技術(shù)從水相中吸附2-苯乙醇以提高其產(chǎn)量.Mei Jianfeng等[19]用大孔吸附樹脂D101吸附2-苯乙醇,最終產(chǎn)量達(dá)到6.2 g/L,其中大孔樹脂吸附量為3.0 g/L.Hua Dongliang等[20]用大孔吸附樹脂HZ818,得到6.6 g/L 2-苯乙醇,摩爾轉(zhuǎn)化率為74.4%,比沒加入時提高了66.2%.關(guān)昂等[21]用大孔吸附樹脂F(xiàn)D0816得到了12.8 g/L 的2-苯乙醇,較原先提高了232%.Wang Hang 等[22]采用原位分離技術(shù)顯著提高了2-苯乙醇的產(chǎn)率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大孔樹脂F(xiàn)D101可以使2-苯乙醇的產(chǎn)率達(dá)到20.1 g/L.Gao Fang等[23]用Hytrel? 8206(熱塑性聚酯)得到13.7 g/L的2-苯乙醇,在這基礎(chǔ)上采用半連續(xù)裝置可使2-苯乙醇產(chǎn)率達(dá)到20.4 g/L,其中,1.4 g/L在水相,97.0 g/L在聚合物相中.大孔樹脂結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,無揮發(fā)性氣味,價格低廉,且在萃取過程中不會影響產(chǎn)品的質(zhì)量,因此,在發(fā)酵體系中添加大孔樹脂,能大大提高2-苯乙醇的產(chǎn)率,在工藝路線中也簡單易行,在工業(yè)生產(chǎn)天然2-苯乙醇中有良好的應(yīng)用前景.

4 結(jié)論和展望

不論植物合成還是微生物發(fā)酵合成2-苯乙醇均可視為天然產(chǎn)品,直接應(yīng)用于食品和日用化妝品中.與化學(xué)合成法相比,生物合成具有毒性小,環(huán)境污染少,產(chǎn)品純凈等優(yōu)點(diǎn).

在植物方面,某些關(guān)鍵性的酶(如AADCs和PAR)的相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)和研究為調(diào)控2-苯乙醇在植物體內(nèi)的合成奠定了基礎(chǔ).

在微生物方面,我國生產(chǎn)L-苯丙氨酸已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,為微生物發(fā)酵合成天然2-苯乙醇提供了基礎(chǔ).目前發(fā)酵2-苯乙醇工藝所需要解決的技術(shù)問題是產(chǎn)物抑制效應(yīng).為提高了生物合成2-苯乙醇的產(chǎn)量,一方面可以通過篩選 2-苯乙醇高耐受性菌株,另一方面可以通過補(bǔ)料分批發(fā)酵和原位分離技術(shù)來降低發(fā)酵液中2-苯乙醇的產(chǎn)物抑制作用.因此,若能將原位分離技術(shù)與高產(chǎn)量菌株和高效發(fā)酵工藝有效結(jié)合,將有望實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的工業(yè)化生產(chǎn).

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Study on Synthesis of 2-Phenylethanol by M icrobes and Plants

HUANG Youhe1, YANG Shangtong1, ZHOU Zhiqiang1, XIONG Juan1, CHEN Hong1,
LIU Yuheng2, JIANG Xingtao2,*
(1.Boton(Shanghai)Flavors and Fragrances Technology Co.Ltd.,Shanghai201201,China; 2.Shenzhen Boton Flavors and Fragrances Co.Ltd.,Shenzhen 518051,China)

2-phenylethanol is an important flavour and fragrance compound,which has positive synergy effects for other aroma components in food,cosmetic,tobacco,and daily chemicals.The metabolism mechanism and latest research of2-phenylethanol in microbes and plantswere reviewed in this paper.

2-phenylethanol;plants;microbes

TS202

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.04.008

2095-6002(2014)04-0041-04

(責(zé)任編輯:葉紅波)

黃友和,楊尚彤,周志強(qiáng),等.植物和微生物合成2-苯乙醇的研究進(jìn)展.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2014,32(4):41-44. HUANG Youhe,YANG Shangtong,ZHOU Zhiqiang,et al.Study on synthesis of 2-phenylethanol by microbes and plants. Journal of Food Science and Technology,2014,32(4):41-44.

2013-05-27

黃友和,男,工程師,碩士,主要從事生物香料的研究與開發(fā)工作;*姜興濤,男,高級工程師,主要從事天然風(fēng)味化學(xué)成分的研究與開發(fā)工作.通訊作者.