付雪艷， 郝文婧， 康小蘭， 董 琳， 張 妍， 張新慧

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川750004)

鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. -Mazz. 的干燥塊根［1］，其性熱，味辛苦，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、活血祛瘀等藥理活性，主要用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛等疾病的治療，是我國(guó)西北地區(qū)(陜、甘、寧、藏)民間治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用藥［2］。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，具有發(fā)病廣、病程長(zhǎng)、致殘率高、不易治愈等特點(diǎn)，RA 的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子的量息息相關(guān)，其中，IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的升高，IL-2 水平的下降是RA 發(fā)病的重要因素。本課題組前期對(duì)鐵棒錘流浸膏治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行了研究，并對(duì)流浸膏大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位進(jìn)行抗炎鎮(zhèn)痛研究，發(fā)現(xiàn)鐵棒錘流浸膏對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用［3-4］。本研究在此基礎(chǔ)上，選用免疫性炎癥模型佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型作為實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型［5-6］，進(jìn)一步研究伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用并在細(xì)胞因子水平探討其作用機(jī)制，為更深入的明確伏毛鐵棒錘的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 伏毛鐵棒錘采購(gòu)于寧夏明德中藥飲片有限公司，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為伏毛鐵棒錘Acontium flavum Hand. -Mazz 的干燥塊根;通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂分離富集得到伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位;雷公藤多苷片 (江蘇美通制藥有限公司，批號(hào)232021007);完全弗氏佐劑 (美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)F5881-10 mL);羧甲基纖維素鈉(天津試劑有限公司);大鼠TNF-α 試劑盒、大鼠IL-1β、IL-2、IL-6 試劑盒均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague-Dawicy(SD)大鼠48 只，雄性，體質(zhì)量(180 ±20)g，動(dòng)物許可證號(hào):SYXY(寧)2006-0001，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。分籠飼養(yǎng)，室溫(22 ±2)℃，相對(duì)濕度45% ～50%，通風(fēng)良好，自然光照的條件下飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.3 伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位的制備將伏毛鐵棒錘塊根洗凈、晾干、粉碎，共得粗粉3 kg，用70%分析乙醇微波回流提取(料液比為1 ∶8，g/mL)，過(guò)濾，濾液合并回收后，減壓濃縮，得到0.3 kg 粗提浸膏。將0.3 kg 粗提浸膏，用蒸餾水制成混懸液后，加入裝有已處理好的D101 大孔吸附樹(shù)脂層析柱中，以2 BV/h 的體積流量吸附有效部位，然后用去離子純化水洗脫，至顏色變淺直到無(wú)色為止;再用30%乙醇洗脫，至顏色變淺直到無(wú)色為止，收集30%乙醇洗脫液，減壓濃縮洗脫液，即得30%醇部位棕黃色流浸膏12 g，將浸膏用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液溶解。伏毛鐵棒錘30%醇部位(高、中、低組)，以0.5%的CMC-Na 水溶液配成6、3、1.5 mg/kg 的溶液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠模型的建立及給藥 AA 大鼠模型制備［7-8］:臨用前從冰箱取出弗氏完全佐劑(CFA)，充分振蕩、混勻。大鼠的右后肢用75%乙醇消毒后將其拉直，用l mL 注射器針頭于足跖皮內(nèi)注射，每只大鼠注射0.1 mL CFA 致炎，正常對(duì)照組注射0.1 mL PBS。將SD 雄性大鼠48 只隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別設(shè)為空白對(duì)照組(0.5%的CMC-Na水溶液)，模型對(duì)照組(0.5%的CMC-Na 水溶液)，陽(yáng)性藥對(duì)照組(雷公藤多苷片0.945 mg/mL)。造模后第8 天開(kāi)始灌胃給藥(給藥體積，1.0 mL/100 g)，每日1 次。30%醇部位高、中、低組以30% 醇部位溶液 (60、30、15 mg/kg)灌服;陽(yáng)性藥對(duì)照組以雷公藤多苷片混懸液(9.45 mg/kg)灌服;空白對(duì)照組、模型對(duì)照組以0.5%的CMC-Na 水溶液灌服。連續(xù)灌胃給藥21 d，于末次給藥2 h后對(duì)大鼠進(jìn)行相應(yīng)處理。

2.2 觀察項(xiàng)目與方法

2.2.1 AA 大鼠繼發(fā)性踝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定 大鼠分別于致炎前1 天以及致炎后第1、8、14、21 和29 天，分別在足容積測(cè)量?jī)x上測(cè)定致炎側(cè)足容積，求出關(guān)節(jié)腫脹度 (△mL=致炎后容積-致炎前容積)以觀察AA 大鼠繼發(fā)性炎癥病變。

2.2.2 AA 大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)定 致炎后第7 天開(kāi)始，每隔4 d 對(duì)大鼠四肢關(guān)節(jié)炎進(jìn)行一次觀察評(píng)分，累計(jì)為關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，AI)，全身病變按5 級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3 只肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。0 分，無(wú)紅腫;1 分，發(fā)紅或小趾關(guān)節(jié)紅腫;2 分，中度腫脹，即趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3 分，踩關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái)，即為每只大鼠的AI。

2.2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察［9-10］10%甲醛溶液中固定48 h 的踝關(guān)節(jié)標(biāo)本，脫鈣處理，即用5%硝酸溶液脫鈣，每天更換脫鈣液，用針刺入標(biāo)本無(wú)阻力感停止脫鈣。脫鈣后標(biāo)本用自來(lái)水流水沖洗多余的固定液，過(guò)夜。在室溫下梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，常規(guī)切片，將組織附于處理過(guò)的載玻片上，60 ℃恒溫烘箱烤片12 h，用于蘇木素-伊紅(HE)染色。HE 染色法:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;蘇木素染色10 min，將細(xì)胞核染成藍(lán)色;0.5%鹽酸乙醇(70%乙醇)分色;0.5%氨水返藍(lán);用自來(lái)水沖洗1 ～2 h;伊紅染色3 min，細(xì)胞質(zhì)染成紅色;用90%乙醇分色處理，鏡下控制。70%乙醇，80%乙醇各2 次;常規(guī)脫水、透明;用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察結(jié)果，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色;照相。

2.2.4 血清細(xì)胞因子檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第29 天末次給藥后2 h，收集標(biāo)本，心臟穿刺取血，搖勻后在4 ℃，3 000 r/min 離心5 min，取上清液測(cè)定。采用ELISA 法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6 水平。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，檢驗(yàn)差異顯著性，以α =0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)AA 模型大鼠右后足腫脹度變化的影響 致炎8 d后模型組及各給藥組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度明顯與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異(P ＜0.05)，表明造模成功。給藥后第15 天，與模型組比，30%醇高、中、低劑量組均可降低AA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度。給藥第29 天，與模型組比，30%醇高、中、低劑量組均可顯著降低AA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，具有顯著性差異(P ＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組AA 大鼠右后足腫脹度的比較(±s，n=8)

表1 各組AA 大鼠右后足腫脹度的比較(±s，n=8)

注:與模型組比較，* P ＜0.05;與空白組比較，△P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg -1)致炎前足跖容積/mL 致炎后足跖腫脹度△/mL 1 d 8 d 15 d 22 d 29 d模型組 - 1.15 ±0.12 0.56 ±0.01△ 0.69 ±0.01△ 0.76 ±0.01△ 0.79 ±0.01△空白組 - 1.12 ±0.110 0.04 ±0.02 0.03 ±0.07 0.03 ±0.01 0.03 ±0.07雷公藤組 9.45 1.10 ±0.09 0.34 ±0.02△ 0.20 ±0.06＊△ 0.24 ±0.01＊△ 0.20 ±0.06＊△30%乙醇高劑量 60 1.20 ±0.10 0.48 ±0.01△ 0.51 ±0.07△ 0.44 ±0.01△ 0.35 ±0.07＊△30%乙醇中劑量 30 1.23 ±0.12 0.40 ±0.01△ 0.37 ±0.07△ 0.30 ±0.01＊△ 0.23 ±0.07＊△30%乙醇低劑量 15 1.00 ±0.10 0.43 ±0.01△ 0.48 ±0.07△ 0.48 ±0.01△ 0.23 ±0.07＊△

3.2 對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 致炎后，正常組大鼠，動(dòng)作敏捷，關(guān)節(jié)無(wú)紅腫;模型組大鼠，動(dòng)作緩慢，非致炎足爪關(guān)節(jié)明顯腫脹，表明造模成功。造模第14 天，非致炎足爪關(guān)節(jié)發(fā)生紅腫，關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時(shí)間推移而逐漸增高，第21 天達(dá)最高。給藥第14 天，30%醇高、中、低劑量組均能使大鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度明顯減輕，明顯低于模型組的指數(shù)(P ＜0.01);給藥第21 天，各組大鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度均減輕，明顯低于模型組的指數(shù)(P ＜0.01)，提示伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位對(duì)AA 大鼠的關(guān)節(jié)炎有一定的抑制作用，如表2 所示。

3.3 HE 染色結(jié)果 對(duì)AA 大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行HE 染色發(fā)現(xiàn)正常大鼠的軟骨組織滑膜襯里層由1-2 層滑膜細(xì)胞組成，表面光滑，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。AA 大鼠模型組的膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生，關(guān)節(jié)間隙變窄，部分關(guān)節(jié)軟骨破壞，滑膜里層細(xì)胞逐漸增加至10 層，細(xì)胞腫脹，部分空泡變性，可見(jiàn)滑膜囊內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，觀察到乳頭狀突出。大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位治療組可使AA 大鼠致炎側(cè)膝關(guān)節(jié)的組織水腫與炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，滑膜細(xì)胞少量增生，關(guān)節(jié)間隙輕度狹窄，癥狀明顯輕于AA 大鼠模型組。提示伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位治療組可使AA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥有明顯的改善作用。見(jiàn)圖1。

表2 不同藥物對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響(±s，n=8)

表2 不同藥物對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) 關(guān)節(jié)炎指數(shù)8 d 14 d 21 d 28 d模型組2.50 ±0.53 5.88 ±0.64 7.38 ±0.74 6.88 ±0.64雷公藤組 9.45 2.13 ±0.64 3.63 ±0.52＊＊ 4.63 ±0.74＊＊ 3.88 ±0.83＊＊30%乙醇高劑量組 60 2.25 ±0.46 4.00 ±0.76＊＊ 5.38 ±0.92＊＊ 4.50 ±0.93＊＊30%乙醇中劑量組 30 2.13 ±0.64 3.88 ±0.64＊＊ 5.00 ±0.53＊＊ 4.13 ±0.83＊＊30%乙醇低劑量組 15 2.25 ±0.46 4.63 ±0.92＊＊ 5.63 ±1.19＊＊ 4.50 ±1.20-＊＊

圖1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠HE 染色

3.4 對(duì)各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6 水平的影響 與正常對(duì)照組大鼠相比，其他各組大鼠在急性關(guān)節(jié)炎造模之后細(xì)胞因子IL-1β 水平顯著上升(P ＜0.05)，模型組大鼠升高程度與正常組大鼠具顯著差異(P ＜0.05)，30%低劑量組AA 大鼠血清TNF-α 水平明顯低于正常對(duì)照組(P ＜0.05)，可顯著降低AA 大鼠血清中產(chǎn)生過(guò)高的TNF-α;與空白對(duì)照組大鼠相比，其他各組大鼠在急性關(guān)節(jié)炎造模之后細(xì)胞因子IL-2 水平顯著降低(P ＜0.05)，與模型組大鼠相比，其他各組大鼠在藥物治療之后細(xì)胞因子IL-2均有上升，伏毛鐵棒錘有效部位30% 部位中劑量組(30 mg/kg)能夠使AA 大鼠過(guò)低的IL-2 水平恢復(fù)最好;與空白對(duì)照組大鼠相比，除伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位中劑量組(30 mg/kg)，其他各組大鼠在急性關(guān)節(jié)炎造模之后細(xì)胞因子IL-6 水平顯著上升(P ＜0.05);與模型組大鼠相比，其他各組大鼠在藥物治療之后細(xì)胞因子IL-6 均有下降，其中陽(yáng)性藥物組、伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位中、高劑量組(30、60 mg/kg)均能夠使AA 大鼠過(guò)高的IL-6 水平恢復(fù)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6 水平測(cè)定

4 討論

RA 是一種以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其主要的發(fā)病機(jī)制是免疫功能的異常所致，T 淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞共同參與了RA 的發(fā)展。這些細(xì)胞因子的局部定位能解釋RA 的許多病變和臨床表現(xiàn)［11-12］。IL-1β 和TNF-α 是重要的炎癥介質(zhì)，多數(shù)情況下表現(xiàn)為協(xié)同生物學(xué)效應(yīng)，能促進(jìn)骨髓釋放中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和多核粒細(xì)胞趨化浸潤(rùn)到炎癥局部，是RA 滑膜炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心和始動(dòng)環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)表明伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位高、中劑量組可以明顯抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的TNF-α、IL-1β 水平，其機(jī)制有可能是伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位抑制了抗原提呈細(xì)胞對(duì)T 細(xì)胞的激活，來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，改善其免疫功能。

RA 骨的丟失與骨髓中IL-6 水平高度相關(guān)，它可促進(jìn)B細(xì)胞合成抗體，刺激T 細(xì)胞增殖［13-14］。IL-2 是保障機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起著重要的作用，具有誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞增殖和分化的作用［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位能夠使AA 大鼠過(guò)低的IL-2 水平恢復(fù)，使過(guò)高的IL-6 水平下降，使紊亂的體液免疫狀態(tài)得到恢復(fù)，起到免疫調(diào)節(jié)作用。

總之，30%乙醇高、中、低劑量組均可降低AA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)，不僅如此，HE 染色表明，鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位治療組可使AA 大鼠致炎側(cè)膝關(guān)節(jié)的組織水腫與炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，滑膜細(xì)胞少量增生，癥狀明顯輕于AA 大鼠模型組。其機(jī)制可能通過(guò)增強(qiáng)抑制IL-1β 和TNF-α 在大鼠體內(nèi)的分泌，阻礙致炎因子IL-6的釋放，以及使IL-2 水平的恢復(fù)，來(lái)調(diào)控大鼠體內(nèi)的各種炎癥因子的平衡，表明伏毛鐵棒錘大孔吸附樹(shù)脂30%乙醇洗脫部位對(duì)RA 起到一定的治療作用，此實(shí)驗(yàn)為更深入地明確伏毛鐵棒錘的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。

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