潘 軍

(濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濱州256618)

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid)是一類具有孕甾烷基本母核，通常同時(shí)具有17-α 羥基和11-氧(羥基或氧代)取代的化合物［1］。糖皮質(zhì)激素與糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育等有著密切的關(guān)系，還具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗毒、抗休克作用。由于糖皮質(zhì)激素類藥物多數(shù)具有明顯的抗炎作用，又可以透過表皮到達(dá)皮下血管發(fā)揮作用。在商業(yè)利益的驅(qū)使下，近年來出現(xiàn)了一些在中藥軟膏制劑中添加糖皮質(zhì)激素類藥物，而在藥品說明書中卻不加以注明的非法制劑。由于糖皮質(zhì)激素本身具有一些影響水、鹽代謝的副作用［2］，與其他藥物合用還會(huì)出現(xiàn)許多不良反應(yīng)［3-6］，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)患者的身體健康造成損害［7］。

目前應(yīng)用于檢測(cè)糖皮質(zhì)激素類藥物的方法較多［8-12］，但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中適合用于快速篩查的方法較少［13-14］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)17 種常見的、可能用于非法添加的糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行了研究，建立了可同時(shí)檢測(cè)17 種糖皮質(zhì)激素類非法添加物的快速篩查方法。本方法操作簡(jiǎn)單，可以使用混合對(duì)照品溶液，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，適合在配置有二極管陣列檢測(cè)器HPLC 的移動(dòng)快檢車內(nèi)操作。適用于基層藥檢工作人員在現(xiàn)有條件下對(duì)市場(chǎng)上的中藥制劑進(jìn)行篩查，對(duì)制假售假和非法添加的行為予以打擊，進(jìn)一步保證人民群眾的用藥安全。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥 Agilent1260 高效液相色譜儀(四元低壓，DAD 檢測(cè)器，Chemstation C01.04 色譜工作站)，乙腈 (色譜純，TEDIA，批號(hào)1203366)，重蒸蒸餾水(自制)，甲酸(分析純，天津市博迪化工有限公司，批號(hào)121001)，對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)見表1。

表1 通常用于非法添加的糖皮質(zhì)激素類藥物Tab.1 Common glucocorticoids adulteration in herbal ointments

1.2 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);以0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相A，以乙腈作為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0 ～15 min，30%B;15 ～30 min，30% ～60%B，30 ～32 min，60%B);體積流量1 mL/min;柱溫箱溫度35.0 ℃;檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍190 ～400 nm，帶寬4 nm;進(jìn)樣量20.0 μL;分析時(shí)間為32 min;后運(yùn)行時(shí)間10 min。

分別取17 種對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，17 種成分色譜峰的峰面積的RSD 均小于0.4%，保留時(shí)間RSD 均小于0.4%，17 種藥品色譜峰的理論板數(shù)均大于10 000。17 種糖皮質(zhì)激素的色譜圖見圖1。結(jié)果表明精密度良好，柱效滿足分析要求。

1.3 樣品制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取17 種糖皮質(zhì)激素對(duì)照品，用乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)溶解，并稀釋至含對(duì)照品10 μg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖1 17 種糖皮質(zhì)激素的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 17 kinds of glucocorticoids

1.3.2 供試品溶液制備 取試樣0.5 g，加乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)適量，超聲10 min 使樣品溶解并定容至50 mL (若樣品難溶，可水浴中適當(dāng)加熱并振搖使軟膏融化，放冷后取水相層)，0.45 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

1.4.1 專屬性 本次實(shí)驗(yàn)選用了華佗膏(上海松華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)121005)、參皇軟膏(吉林吉春制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)121028)、蟹黃膚寧軟膏(山東明仁福瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)13501009)、冰黃膚樂軟膏(西藏芝芝藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130802)、丹皮酚軟膏(合肥立方制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20130614)、丹皮酚軟膏(吉林吉春制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130763)、復(fù)方片仔癀軟膏(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130203)作為陰性樣品，按“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備陰性樣品及分別含有17 種目標(biāo)成分的陽(yáng)性樣品的供試品溶液。用上述分析條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果陽(yáng)性樣品均檢出目標(biāo)成分，陰性樣品無(wú)干擾。陰性樣品和陽(yáng)性對(duì)照的色譜圖見圖2。

圖2 陰性樣品和陽(yáng)性對(duì)照色譜圖Fig.2 Chromatograms of negative sample and positive reference sample

1.4.2 線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品溶液1、2、4、8、20 μL 進(jìn)樣，其他分析條件按照“1.2”項(xiàng)中的參數(shù)測(cè)定，以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r 均不低于0.99 (n =5)，表明17種糖皮質(zhì)激素類藥物在0.5 ～10 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系滿足篩查需求。

1.4.3 回收率試驗(yàn) 在陰性樣品中添加17 種糖皮質(zhì)激素對(duì)照品，添加水平為0.1、0.5、1 mg/g，用本方法平行測(cè)定5 次。17 種激素的平均回收率在71% ～106%之間，RSD 均小于5%，結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度能夠滿足快速篩查的需要。

1.4.4 檢測(cè)限 按信噪比(S/N)為3 時(shí)計(jì)算，17 種糖皮質(zhì)激素類非法添加物的檢測(cè)限均在30 μg/mL以下;按信噪比(S/N)為10 時(shí)計(jì)算，17 種糖皮質(zhì)激素類非法添加物的定量限均在100 μg/mL 以下。

1.5 光譜特征 本實(shí)驗(yàn)中的17 種糖皮質(zhì)激素色譜峰峰頂?shù)墓庾V吸收?qǐng)D比較類似且特征明顯，在190 ～400 nm 范圍內(nèi)只有1 處最大吸收，且最大吸收波長(zhǎng)范圍均在241 ～24 6 nm。

2 討論

2.1 非法添加化學(xué)藥品要保證其有效性，必須保證添加物的濃度達(dá)到藥物的起效濃度，因此添加化學(xué)物質(zhì)的濃度通常較高，容易被分析儀器檢出?？紤]到糖皮質(zhì)激素類藥物局部外用的臨床治療質(zhì)量濃度多為0.1 ～2.5 mg/mL［15］，因此本實(shí)驗(yàn)在對(duì)照品溶液的選擇上采用了10 μg/mL。

2.2 在流動(dòng)相的選擇上，本實(shí)驗(yàn)中有9 種糖皮質(zhì)激素為酯化衍生物，在流動(dòng)相中加入少量的酸可增加被檢測(cè)物質(zhì)的穩(wěn)定性。乙腈在紫外區(qū)的截止波長(zhǎng)范圍優(yōu)于甲醇，所以選擇了乙腈作為有機(jī)相，0.1%甲酸作為水相的流動(dòng)相組成。

2.3 本實(shí)驗(yàn)采用了配有二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀，在色譜峰達(dá)到較好分離的基礎(chǔ)上，可以利用光譜吸收進(jìn)行初步定性。本實(shí)驗(yàn)中17 種糖皮質(zhì)激素光譜圖比較簡(jiǎn)單且特征明顯，在保留時(shí)間和光譜吸收均一致的情況下，假陽(yáng)性的出現(xiàn)概率是非常低的。

2.4 由于存在某些化學(xué)物質(zhì)與本實(shí)驗(yàn)中的17 種糖皮質(zhì)激素色譜峰保留時(shí)間和光譜吸收相似的可能性，本方法適用于快速篩查，必要時(shí)需要用LC-MS和NMR 等設(shè)備進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，避免假陽(yáng)性的判斷。

［1］ 尤啟東. 藥物化學(xué)［M］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:580-581.

［2］ Parker M. Steroid hormone action ［M］. New York:Oxford，1993.

［3］ 杜 昆. 腎上腺皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)［J］. 首都醫(yī)藥，2000，7(8):62.

［4］ 周 彬，劉 建，朱 靜，等. 糖皮質(zhì)激素類藥物的不良反應(yīng)和并發(fā)癥［J］. 中國(guó)藥業(yè)，2002，11(6):43-44.

［5］ 李 森，謝人明，孫文基. 杜仲籽總苷抗糖皮質(zhì)激素所致小鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中成藥，2010，32(2):205-208.

［6］ 李永清. 糖皮質(zhì)激素的藥理作用及不良反應(yīng)［J］. 北方藥學(xué)，2013，10(11):32-33.

［7］ Schakman O，Gilson H，Kalista S，et al. Mechanisms of muscle atrophy induced by glucocorticoids［J］. Horm Res，2009，72(Suppl 1):36-41.

［8］ 孫雪婷，商少明，陳秀英，等. 微乳毛細(xì)管電色譜電動(dòng)進(jìn)樣-場(chǎng)放大堆積法檢測(cè)化妝品中糖皮質(zhì)激素［J］. 分析化學(xué)，2014，42(1):36-40.

［9］ 胡擁明，王利兵，袁 媛，等. 糖皮質(zhì)激素ELISA 檢測(cè)方法的建立及群選性抗體的篩選［J］. 食品科學(xué)，2009，30(24):331-336.

［10］ 凌 霄，徐志洲，牛 沖. HPLC/MS/MS 法檢測(cè)中藥制劑中解熱鎮(zhèn)痛及糖皮質(zhì)激素類化學(xué)藥［J］. 藥物分析雜志，2010，30(7):1311-1314.

［11］ 嚴(yán) 華，云 環(huán)，劉 鑫，等. UHPLC-LTQ Orbitrap MS測(cè)定雞肉組織中5 種糖皮質(zhì)激素殘留［J］. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(8):909-914.

［12］ 李 萌，金勉勉，陳 新，等. 場(chǎng)放大進(jìn)樣-膠束毛細(xì)管電泳法測(cè)定化妝品中3 種糖皮質(zhì)激素［J］. 理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè))，2013，49(4):435-438.

［13］ 夏 瑞，董素英，車寶泉. 薄層色譜法快速鑒別中藥制劑中的糖皮質(zhì)激素［J］. 藥物分析雜志，2008，28(3):470-471.

［14］ 夏 瑞，車寶泉. RP-HPLC 方法鑒別中藥制劑中的糖皮質(zhì)激素［J］. 藥物分析雜志，2008，28(2):316-318.

［15］ 吳志華，郭紅衛(wèi). 糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制進(jìn)展及在皮膚科中的應(yīng)用［J］. 皮膚病與性病，2011，33(6):323-324.