靜亮，彭希，謝敏杰，喻志源，呂家高，王偉

SM22α啟動子靶向性調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞過表達(dá)p27的研究

靜亮a，彭希a，謝敏杰a，喻志源a，呂家高b，王偉a

目的：構(gòu)建由SM22α特異性啟動子介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）靶向性過表達(dá)p27蛋白的慢病毒載體來研究對VSMCs細(xì)胞周期的影響。方法：構(gòu)建重組慢病毒載體（Lenti-SM22α-p27-EGFP），感染原代培養(yǎng)的VSMCs及內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）。結(jié)果：SM22α-p27慢病毒能對VSMCs表現(xiàn)出高效且精確的抑制作用。SM22α啟動子靶向標(biāo)記的p27能在VSMCs內(nèi)過表達(dá)，且通過G0/G1期阻滯來抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論：由SM22α特異性啟動子驅(qū)動的重組慢病毒載體能選擇性感染VSMCs，有效地引起p27蛋白過表達(dá)并產(chǎn)生G0/G1期阻滯。

支架術(shù)后再狹窄；藥物洗脫支架；重組慢病毒；細(xì)胞周期

藥物洗脫支架能降低血管狹窄的發(fā)生，支架術(shù)后再狹窄為常見的并發(fā)癥[1]。同常規(guī)的經(jīng)皮冠脈介入治療相比，藥物洗脫支架植入后短期再狹窄率能降至10%～30%[2]。然而，諸如紫杉醇或西羅莫司等洗脫藥物不僅抑制新生內(nèi)膜增生，也限制再內(nèi)皮化的進(jìn)程，并最終導(dǎo)致晚期支架栓塞的發(fā)生[3]。藥物洗脫支架并不適用于糖尿病、冠脈畸形等患者[4]。因此，一種針對藥物洗脫支架對患者的遠(yuǎn)期預(yù)后并無益處的觀點逐漸形成[5]。尋找到一種能雙向調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞 （vascular smooth muscle cells，VSMCs）和內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）的藥物或許能解決這個問題。

VSMCs能被一系列靶點所標(biāo)記，如α肌動蛋白、激酶相關(guān)蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、SM22α蛋白[6,7]。其中，SM22α的分子量為22 kDa，于胚胎早期開始在VSMCs內(nèi)表達(dá)。SM22α既往曾被用作VSMCs系的表型標(biāo)記物[8]，大鼠SM22α有一個高水平轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的啟動子。SM22α啟動子包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，總長6 271 bp[9]，曾被廣泛用作轉(zhuǎn)基因治療的靶點。Frutkin等[10]成功通過SM22α啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)化生長因子 β受體誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)的Cre酶過表達(dá)。Clarke等[11]在大鼠動脈粥樣硬化模型中構(gòu)建SM22α啟動子-人白喉毒素受體過表達(dá)載體。

在經(jīng)皮冠脈介入術(shù)引起的機(jī)械性、炎性損傷環(huán)境中，VSMCs和VECs的細(xì)胞周期通過G0/G1期轉(zhuǎn)換得到激活[12]。然而，目前臨床最常用的洗脫藥物紫杉醇卻通過在G2/M期與微管亞單元結(jié)合，從而阻止有絲分裂。與此同時，增殖還受到細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶和細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑等一系列蛋白共同調(diào)控。p27多被認(rèn)為是一種動脈損傷后VSMCs的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子[14]。p27過表達(dá)能引起大鼠球囊損傷模型中VSMCs增殖明顯抑制[15]。p27敲除的大鼠模型會出現(xiàn)動脈損傷后的內(nèi)膜增厚[16]。

為了降低晚期支架栓塞和支架術(shù)后再狹窄的發(fā)生，一種理想化的治療方式應(yīng)在損傷局部保持長期高效的藥物濃度。為了選擇性抑制新生內(nèi)膜增生而不影響再內(nèi)皮化，本研究構(gòu)建重組慢病毒載體Lenti-SM22α-p27-EGFP，它包含特異性啟動子、p27和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因；同時還構(gòu)建僅含有特異性啟動子和 EGFP基因的對照病毒Lenti-SM22α-null-EGFP，討論紫杉醇和重組慢病毒干預(yù)后的VSMCs周期差異。

1 材料與方法

1.1 材料

紫杉醇、DAPI購于美國Sigma公司，ViraPower系統(tǒng)購于美國 Invitrogen公司，兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）購于美國Abcam公司，小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）購于中國 Boster公司，Cy3標(biāo)記的抗兔 IgG、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG購于美國Jackson實驗室。流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 SM22α啟動子克隆方法 SM22α啟動子和GAPDH由PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增（SM22a上 游 引 物 5'-GCCTTAATTAATTTGCATAGTGCCTGGTTG-3'，下游 引 物 5'-CGCGGATCCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3'，GAPDH上游引物5'-TGCCCACCAGAACATCAT-3'，下游引物5'-TAGCCATATTCGTTGTCGTA-3'）。循環(huán)體系：94℃預(yù)變性10 min，（94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s）×30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建與準(zhǔn)備 SM22α啟動子的全套編碼序列協(xié)同p27（本實驗預(yù)存）和EGFP基因或單獨的EGFP基因（對照病毒）都被整合入慢病毒載體，該病毒通過ViraPower系統(tǒng)在中國上海吉凱公司進(jìn)行合成。

1.2.3 原代細(xì)胞培養(yǎng) VECs和VSMCs均取材于SD大鼠胸腹主動脈弓。大動脈取材自腎動脈至降主動脈弓，完全剝離外膜，用無菌PBS洗滌。VSMCs：將動脈切成1 mm2大小的碎塊，37℃消化2 h（含250 U/mL二型膠原酶的DMEM F12培養(yǎng)基），1 000 rpm離心5 min，棄上清，VSMCs在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基）。VECs：輕柔翻轉(zhuǎn)動脈，兩端結(jié)扎，直接貼附于Ⅰ型鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中（含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基）。VSMCs和VECs的純度分別通過SMA和vWF進(jìn)行檢測。后續(xù)實驗中VSMCs和VECs均以特定密度進(jìn)行種植，統(tǒng)一24 h后饑餓干預(yù)（不含胎牛血清的單純培養(yǎng)基）12 h后開展實驗。

1.2.4 免疫熒光分析 將培養(yǎng)的細(xì)胞用無菌PBS清洗3次，冰甲醇固定，37℃固定15 min后，用含0.2%的Triton X-100在37℃破膜15 min，4℃抗體阻斷液孵育8 h，在PBS震蕩5 min后，孵育一抗：兔抗vWF（1∶400）與小鼠抗α-SMA（1∶200）4℃下孵育8 h，再次用PBS洗滌后，分別加入二抗：Cy3標(biāo)記的抗兔IgG（1∶1 000），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠IgG（1∶1 000）37℃孵育1 h，繼續(xù)用DAPI（10 μg/mL）37℃下孵育5 min，用Olympus BX51型熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞分析 4×104/mL VECs和VSMCs種于6 cm培養(yǎng)皿24 h后，將2種病毒 Lenti-SM22α-p27-EGFP（p27組）和Lenti-SM22α-null-EGFP（null組）分別以最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）0、10、50、100分別感染 VECs和VSMCs，并以等量PBS作為對照組。72 h后，胰酶消化細(xì)胞，800 rpm離心5 min，棄上清，細(xì)胞（10 000）由4℃無菌PBS重懸。細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀統(tǒng)計EGFP陽性細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)3次。1.2.6 Western-Blot分 析 1×105/mL VSMCs種于 10 cm平皿中 24 h后，50 nmol/L紫杉醇和MOI=10的重組慢病毒干預(yù)24 h，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后，無菌PBS清洗，4℃加入RIPA裂解液30 min，12 000rpm離心25 min，將上清混合5×上樣緩沖液，110℃水浴變性15 min。羅氏反應(yīng)試劑盒檢測蛋白濃度。Bio-Rad系統(tǒng)電泳與轉(zhuǎn)膜，37℃脫脂奶粉封閉1 h后孵育一抗：鼠抗cyclinB1（1∶ 1 000），鼠抗cyclinA（1∶1000），鼠抗cyclinE（1∶500），兔抗 cyclinD1（1∶500），鼠抗PCNA（1∶500），兔抗p27（1∶2 000），鼠抗p21（1∶200）和兔抗SMA（1∶2 000），二抗均用1∶10 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG。陽性條帶通過ECL發(fā)光，X膠片采集后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較用法，結(jié)果以（±sEM）表示，＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SM22α啟動子基因克隆

通過預(yù)設(shè)計的上下游引物，SM22α啟動子的編碼序列用PCR方法進(jìn)行檢測。外顯的DNA序列集中于550 bp（圖1）。對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增、測序證實PCR產(chǎn)物含有TATA盒、CArG盒、SP1、YY1和其他重要功能性結(jié)構(gòu)。

圖1 大鼠基因組中SM22a啟動子的釣取

2.2 培養(yǎng)細(xì)胞鑒定

將進(jìn)行3次傳代后的原代培養(yǎng)的VSMCs和VECs種植于蓋玻片上并進(jìn)行免疫熒光染色（圖2）。將熒光染色陽性的細(xì)胞同DAPI結(jié)果進(jìn)行比對，該原代培養(yǎng)細(xì)胞純度≥90%。

圖2 VSMCs(A)和VECs(B)（免疫熒光染色）

2.3 SM22α啟動子對VSMCs的選擇性感染能力

從72 h起，被感染的VSMCs內(nèi)出現(xiàn)EGFP表達(dá)（圖3A）。通過流式細(xì)胞儀中慢病毒表現(xiàn)出的高效感染能力（圖3B），將MOI=10作為最佳感染指標(biāo)。在VSMCs中，p27組同對照組相比，EGFP陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)（72.39±7.24）%（＜0.05）。null組同對照組相比，EGFP陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)（81.45± 8.17）%（＜0.05）。同等MOI下，兩種病毒對VSMCs的感染差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。VECs均無表達(dá)EGFP能力。

圖3 重組慢病毒對VSMCs和VECs的雙向感染能力

2.4 重組慢病毒對VSMCs的細(xì)胞周期調(diào)控

與對照組和 null組相比，p27組VSMCs的cyclinE1和PCNA受到明顯抑制，p27含量升高（＜0.05，圖4）。null組中，VSMCs的cyclinD1含量明顯降低（＜0.05，圖4）。

圖4 紫杉醇和慢病毒干預(yù)VSMCs細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)

3 討論

新生內(nèi)膜增生是支架術(shù)后再狹窄的主要病因。目前，大量的研究手段均被用于離體或在體實驗以實現(xiàn)新生內(nèi)膜的抑制[17,18]。但這些研究方法均被證實不適用于臨床實驗。盡管早期的研究結(jié)果表明藥物洗脫支架能有效影響再狹窄的形成，當(dāng)下的實驗結(jié)果依舊提示使用藥物支架再狹窄的發(fā)生率為10%～30%，并伴隨晚期支架栓塞等并發(fā)癥。藥物洗脫支架在抑制新生內(nèi)膜的同時也會干預(yù)再內(nèi)皮化的進(jìn)程。因此，理想化的治療方案應(yīng)當(dāng)具備VSMCs特異性抑制增殖作用，而不影響VECs的理論，得到越來越多的認(rèn)可[19]。為了證實這種觀點，本研究通過VSMCs和VECs研究SM22α的靶向性作用。

盡管藥物洗脫支架能誘導(dǎo)VSMCs和VECs的增殖，其細(xì)胞周期差異尚不十分明確。然而，相關(guān)研究證實G1/S期轉(zhuǎn)換參與支架術(shù)后細(xì)胞活化進(jìn)程。p27通過對cyclinE/CDK2復(fù)合物活性的抑制調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換，也被認(rèn)為是一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。除此之外，p27也被一系列洗脫藥物直接作用，如雷帕霉素、西羅莫司和紫杉醇[21-23]。在以上藥物中，紫杉醇一直被認(rèn)為通過G2/M期阻滯產(chǎn)生作用。然而，近年來相關(guān)研究證實紫杉醇也能夠?qū)1/S期阻滯產(chǎn)生作用[24]。因此，本研究構(gòu)建SM22a啟動子驅(qū)動的過表達(dá)p27重組慢病毒來研究VSMCs特異性的G0/G1阻滯是否能夠有效抑制增殖。

本研究結(jié)果顯示重組慢病毒能特異性感染VSMCs，并有效抑制細(xì)胞增殖。盡管近年來相關(guān)研究開拓了一系列方法來改進(jìn)藥物洗脫支架，其中大部分依然局限在找到一種能夠在損傷局部產(chǎn)生新型細(xì)胞周期干預(yù)途徑的藥物[25,26]。基因治療不僅能夠靶向性抑制VSMCs增殖，還能在小范圍內(nèi)長期穩(wěn)定的表達(dá)。

本研究中Western-blot結(jié)果證實重組慢病毒能靶向性影響 VSMCs到cyclinD1、p27和PCNA的表達(dá)。PCNA的表達(dá)量說明過表達(dá)p27能出現(xiàn)更明顯的增殖抑制作用。在血管重塑晚期，p27含量通常受到VECs的影響而上調(diào)[28]。這種生理進(jìn)程往往受到藥物的影響而發(fā)生紊亂。Lenti-SM22α-p27能避免對內(nèi)皮的抑制作用，并直接引起VSMCs自表達(dá)的p27含量增加，進(jìn)而更好地抑制再狹窄發(fā)生。

綜上所述，Lenti-SM22α-P27-EGFP重組慢病毒已在離體實驗中被證實能安全高效地通過 G0/G1期阻滯，抑制VSMCs增殖，VECs的修復(fù)也未受到影響。重組慢病毒對細(xì)胞周期提供更為精確的調(diào)控作用，這些特點都為支架術(shù)后再狹窄治療方案的改進(jìn)提供了新的思路。

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Targeted over-expression p27 by Lenti-SM22alpha-p27-EGFP Recombinant Lentiviral Vectors on Vascular Smooth Muscle Cells

Objective:To construct Lenti-SM22alpha-p27-EGFP recombinant lentiviral vectors targeting vascular smooth muscle cells (VSMCs)and to investigate the impact on VSMCs proliferation by cell cycle analysis. Methods:Recombinant lentiviruses were constructed.The viruses were transfected into VSMCs and vascular endothelial cells(VECs).Results:SM22α-p27 lentiviruses exhibited effective and specific inhibition on VSMCs. SM22α promoter targeted p27 was able to be selectively over-expressed in VSMCs and to inhibit proliferation by cell cycle arrest at G0/G1.Conclusion:Recombinant lentiviruses driven by SM22α promoter could selectively infect VSMCs,thus lead to p27 protein over-expression and G0/G1 arrest.

in-stent restenosis;drug-eluting stents;recombinant lentivirus;cell cycle

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.005

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科 b.心內(nèi)科武漢 430030

國家自然科學(xué)基金（No.81030021，30870 641）

2014-03-01

王偉wwang@tjh.tjmu.edu. cn