張運(yùn)康，陶連方

·基礎(chǔ)研究·

經(jīng)顱磁刺激對腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及GAP-43表達(dá)的影響

張運(yùn)康，陶連方

目的：觀察經(jīng)顱磁刺激（TMS）對腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及GAP-43表達(dá)的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組及TMS組，各10只；建立腦出血模型；TMS組于造模后24 h開始給予TMS治療，1次/d，連續(xù)治療14 d；采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測血腫周圍組織GAP-43陽性細(xì)胞情況。結(jié)果：TMS組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯較模型組改善（＜0.01）；TMS組血腫周邊GAP-43陽性細(xì)胞顯著多于模型組（＜0.01）；4組均未見自發(fā)性出血及癲癇發(fā)作。結(jié)論：TMS可改善腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，TMS治療后，血腫周圍GAP-43表達(dá)上調(diào)。

腦出血；經(jīng)顱磁刺激；Morris水迷宮；生長相關(guān)因子-43

經(jīng)顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是一項(xiàng)無痛、無創(chuàng)、操作簡單且安全可靠的神經(jīng)電生理技術(shù)，目前不僅在運(yùn)動神經(jīng)功能完整性診斷中廣泛應(yīng)用，而且還在治療腦梗死、帕金森病、癲癇及抑郁癥等方面均取得了較好的療效[1,2]，但其在腦出血中運(yùn)用報道尚少。本研究旨在觀察TMS對腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血腫周圍生長相關(guān)因子（growth-associated factor-43，GAP-43）表達(dá)的影響，以探討其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用TMS治療腦出血提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性成熟SD大鼠40只，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量（220±20）g；大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組及TMS組，每組10只；各組均予以自由飲水及正常喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與材料 VII型膠原酶（購于美國sigma公司）；STOELTING TL-2型鼠腦立體定位儀（購于美國 Stoelting公司）；Morris水迷宮，Ethovision系統(tǒng)（購于荷蘭Noldus公司）；鼠抗兔免疫組化（DAB）試劑盒（購于北京欣博盛生物科技公司）；兔抗GAP-43抗體（購于武漢博士德生物工程有限公司）；微量進(jìn)樣器、手術(shù)剪、手術(shù)鑷等手術(shù)器械（購于上海醫(yī)療器械廠）；10%水合氯醛（十堰市人民醫(yī)院藥劑科提供）。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型建立 參照Rosenberg法[3]制作腦出血模型，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后將其固定在鼠腦立體定位儀上，根據(jù)《大鼠立體定位圖譜》[4]進(jìn)行蒼白球定位：前囟后1.4 mm，中線右側(cè)旁開3.2 mm，鉆孔，向下進(jìn)針5.6 mm，以微量注射器緩慢向右側(cè)蒼白球注射含有0.2 U/μL VII型膠原酶的生理鹽水2 μL，留針5 min。正常組不做任何處理。假手術(shù)組用同樣方法鉆孔、進(jìn)針，2 μL無菌生理鹽水替代膠原酶注射。模型組與TMS組制作腦出血模型。

1.2.2 TMS治療 TMS組大鼠于造模24 h后開始用行TMS治療，固定大鼠頭部，線圈水平放于實(shí)驗(yàn)大鼠頭部上方，線圈中心準(zhǔn)確對于右側(cè)頭顱中央，刺激頻率0.5 Hz，脈沖磁場峰值強(qiáng)度1.44 T，連續(xù)刺激60次，每天治療1次，連續(xù)治療14 d。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測定 治療14 d后，采用Morris水迷宮對各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試。Morris水迷宮水溫控制在（25±2）℃，平臺高于逃逸平面2 cm，周圍設(shè)置在實(shí)驗(yàn)時一致。按水池4個象限分別將實(shí)驗(yàn)大鼠置入水池，大鼠若在60 s內(nèi)尋找到目標(biāo)平臺且在平臺上停留15 s則將其撈起，取大鼠從象限出發(fā)到尋找到目標(biāo)平臺所需的時間，稱為逃避潛伏期；若大鼠不能在60 s內(nèi)尋找到目標(biāo)平臺，由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺，停留在平臺上15 s后將其撈起，逃避潛伏期記為60 s。依據(jù)上述方法每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練5 d，用第6天記錄的結(jié)果評定其空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.4 血腫周圍GAP-43蛋白的表達(dá) 水迷宮測試結(jié)束，處死大鼠，斷頭取腦后固定于4%多聚甲醛內(nèi)過夜固定，置入30%蔗糖溶液，待組織沉底后進(jìn)行切片。每只大鼠腦組織均取同樣層面的切片放入3%H2O2溶液中1 h；滴加正常羊血清封閉30 min；滴加一抗后4℃下孵育24 h；再滴加相應(yīng)二抗工作液，室溫下反應(yīng)30 min，加辣根酶標(biāo)記卵白素工作液，室溫孵育30 min；新鮮配制的DAB顯色劑顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間；蒸餾水洗滌3次終止反應(yīng)；常規(guī)脫水、透明、封片；于光鏡下觀察、記錄結(jié)果及拍照，于200倍鏡下，隨機(jī)取5個視野，計數(shù)GAP-43陽性細(xì)胞。

1.2.5 不良反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)過程中，4組大鼠均未見自發(fā)性出血及癲癇發(fā)作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果

表1 各組大鼠逃避潛伏期及GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期及GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

注：與正常組及假手術(shù)組比較組比較，①＜0.05；與模型組比較，②＜0.05

組別 只數(shù) 逃避潛伏期/s GAP-43個/視野正常組 10 13.88±0.60 9.40±1.24假手術(shù)組 10 14.12±0.43 10.3±0.98模型組 10 34.34±0.67① 17.0±1.12①TMS組 10 23.27±0.71①② 23.65±1.31①②

2.2 血腫周圍GAP-43蛋白表達(dá)

GAP-43陽性細(xì)胞表達(dá)主要為神經(jīng)元胞漿及突起著棕黃色；正常組與假手術(shù)組腦組織中僅存在少量GAP-43陽性細(xì)胞表達(dá)，2組間陽性細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；模型組與 TMS組GAP-43陽性細(xì)胞表達(dá)明顯多于正常組及假手術(shù)組（＜0.01）；TMS組GAP-43陽性細(xì)胞表達(dá)多于模型組（＜0.01），見表1及圖1。

圖1 免疫組化檢測模型組（A）及TMS組（B）GAP-43陽性細(xì)胞（光鏡，×20）

3 討論

TMS是1985年由英國的Barker等[5]首創(chuàng)的一種非侵入性的腦科學(xué)技術(shù)[6]，能直接刺激及誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)活動，且能通過調(diào)節(jié)其強(qiáng)度、頻率、持續(xù)時間與刺激間歇等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性產(chǎn)生影響，目前已在神經(jīng)康復(fù)學(xué)、臨床神經(jīng)學(xué)和精神心理學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。TMS能易化運(yùn)動傳導(dǎo)通路，可促進(jìn)皮質(zhì)功能的重建及突觸的生成，進(jìn)而促進(jìn)運(yùn)動功能康復(fù)[6]；TMS還能影響腦神經(jīng)遞質(zhì)的生成，如可促進(jìn)乙酰膽堿水平的升高，而乙酰膽堿的增加又能促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)[7]；另外，TMS還能增加局部腦血流量和血流速度，顯著改善腦梗死后缺血半暗帶，且腦血流量的增加又可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長，形成新的軸突及樹突[8]。學(xué)者們早期從TMS治療機(jī)制分析，認(rèn)為將其應(yīng)用于腦出血治療應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度，其主要著眼點(diǎn)是關(guān)于TMS運(yùn)用于腦出血的安全性問題，即是否會引起繼發(fā)性腦出血與癲癇發(fā)作等損傷；近年來認(rèn)為，TMS在采用常規(guī)臨床參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)情況時不會對神經(jīng)組織造成損傷和出血，且可減輕腦水腫及保護(hù)缺血神經(jīng)細(xì)胞[9]。且本研究中，TMS組大鼠未見自發(fā)性出血及癲癇發(fā)作。目前關(guān)于TMS是否對腦出血有治療作用，是否在對腦出血后神經(jīng)修復(fù)與重建中起著重要作用，成為一個值得研究的問題。

GAP-43是一種軸突膜蛋白，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于軸突生長錐質(zhì)膜面，能通過使生長錐基底部胞漿膜加速擴(kuò)展來促進(jìn)軸突生長，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及再生過程中高水平表達(dá)，目前被認(rèn)為是一種研究神經(jīng)生長發(fā)育與損失修復(fù)等神經(jīng)可塑性的標(biāo)志物[10]；當(dāng)腦組織受到損傷后，損傷周圍神經(jīng)細(xì)胞GAP-43表達(dá)可成倍增加[11]，表現(xiàn)為反應(yīng)性軸突再生及側(cè)枝出芽，表明在受損神經(jīng)區(qū)域有反應(yīng)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建[12]。腦出血作為臨床一種急癥，不僅能夠促進(jìn)血腫周圍組織釋放許多炎性因子而損傷腦組織，還能促進(jìn)某些神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放而保護(hù)腦組織。本實(shí)驗(yàn)通過在用膠原酶誘發(fā)的腦出血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腦出血后GAP-43表達(dá)明顯增多，這可能與腦出血后所激發(fā)的機(jī)體一種自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)；運(yùn)用TMS治療腦出血大鼠過程中未觀察到大鼠有繼發(fā)性腦出血、癲癇發(fā)作等損傷，且TMS組大鼠逃避潛伏期明顯較模型組降低，表明TMS可有效改善腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；同時還發(fā)現(xiàn)運(yùn)用TMS治療后可見血腫周圍GAP-43表達(dá)明顯較模型組增多。筆者推測TMS對腦組織的保護(hù)作用，可能與促進(jìn)血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合成GAP-43有關(guān)。但TMS是通過何種途徑促進(jìn)腦出血周圍組織GAP-43表達(dá)的增加具體機(jī)制還未清楚，仍有待進(jìn)一步的探討研究。

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R741；R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.025

湖北醫(yī)學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院老年病科湖北 十堰 441000

2014-03-11

陶連方taolianf@126.com