唐協(xié)林，姚慶寧，夏祥國，黎乾科，劉勝華，肖奎，顧應(yīng)江，鐘俊，趙超

補(bǔ)體C3、C4在家犬腦出血模型中的變化

唐協(xié)林1，姚慶寧1，夏祥國2，黎乾科1，劉勝華1，肖奎1，顧應(yīng)江2，鐘俊1，趙超1

目的：研究家犬腦出血（ICH）模型補(bǔ)體C3、C4與血腫周圍腦水腫的關(guān)系。方法：30只家犬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、影像組和血腫組3組各10只。正常對(duì)照組不予任何處理，影像組和血腫組采用立體定向自體血腦內(nèi)注入法制備ICH模型。正常對(duì)照組和影像組分別于術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d檢測外周靜脈血C3、C4含量，各時(shí)間點(diǎn)行頭顱CT掃描并計(jì)算水腫比值。血腫組分別于術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d檢測血腫液C3、C4含量。各時(shí)間點(diǎn)采用Purdy PD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估神經(jīng)功能缺損。結(jié)果：影像組和血腫組外周血、血腫液補(bǔ)體C3、C4含量術(shù)后6 h開始升高，72 h達(dá)高峰，之后逐漸下降。影像組、血腫組與正常對(duì)照組比較，術(shù)后6 h外周血C4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），其余同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。ICH后Purdy PD評(píng)分即有所下降，72 h下降為最低，之后逐漸升高。結(jié)論：ICH后補(bǔ)體C3、C4激活可能參與血腫周圍腦水腫形成和繼發(fā)性腦損害的病理過程。

腦出血；免疫組織化學(xué)；補(bǔ)體C3；補(bǔ)體C4；腦水腫

目前腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）發(fā)病率、致殘率、死亡率均較高。ICH的病理生理機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效的治療手段。ICH后血腦屏障破壞，血漿中補(bǔ)體進(jìn)入腦組織，補(bǔ)體沿著不依賴抗體的經(jīng)典途徑激活，打破了腦組織內(nèi)原有補(bǔ)體系統(tǒng)平衡。在補(bǔ)體蛋白家族中，C3含量最多，而且是3條激活途徑（經(jīng)典激活途徑、旁路激活途徑和甘露聚糖結(jié)合凝集素激活途徑）中的共同通路，是補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵分子，因此常被作為補(bǔ)體激活的指標(biāo)。C4在介導(dǎo)補(bǔ)體損傷方面也有至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)體C3、C4在實(shí)驗(yàn)性ICH家犬外周血、血腫液中含量，探討ICH血腫周圍腦水腫及繼發(fā)性腦損害的可能機(jī)制，為臨床治療ICH提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性家犬30只，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量11～13 kg，月齡10～12月，血常規(guī)正常。

1.1.2 主要試劑 與儀器 C3（T503025）、C4（T403025）、CA（T502270）、Pf（407016）試劑購于美國Beckman Coulter公司，批內(nèi)變異系數(shù)均＜10%；羊抗人C3、C4多克隆抗體購于美國Sigma公司；免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司；Array 360全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)、Array 360免疫化學(xué)分析系統(tǒng)購于美國Beckman公司。

1.2 方法

30只家犬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、影像組、血腫組3組各10例，各組月齡、體質(zhì)量、神經(jīng)功能比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。正常對(duì)照組不予任何處理，于實(shí)驗(yàn)開始后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d取小腿外側(cè)靜脈血；影像組和血腫組制備ICH模型，影像組分別于術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d取外周靜脈血，各時(shí)間點(diǎn)（n=2）行頭顱CT掃描；血腫組沿原手術(shù)創(chuàng)道分別取術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d血腫液，各時(shí)間點(diǎn)（n=2）進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。采用立體定向自體血腦內(nèi)注入法制備ICH模型：①手術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。術(shù)前氯胺酮15 mg/kg、阿托品0.04 mg/kg、安定10 mg肌肉注射麻醉，小腿外側(cè)靜脈置入留置針后，以3%戊巴比妥鈉40 mg/kg緩慢靜脈推注。當(dāng)犬出現(xiàn)呼吸淺慢，角膜反射遲鈍，舌外伸時(shí)，為麻醉適度表現(xiàn)。如出現(xiàn)呼吸抑制，立即靜推尼可剎米0.375 g、洛貝林3 mg，擠壓胸廓輔助呼吸后可恢復(fù)自主呼吸。②CT定位：犬俯臥于CT檢查床上，頭部剪毛后用特殊縛帶固定，以外耳道連線為基線并用龍膽紫標(biāo)記，采用Siemens 16 CT Sensation掃描機(jī)垂直進(jìn)行掃描（冠狀位）。掃描參數(shù)：層厚5 mm，層距5 mm，視野（FOV）160，電壓120 kV，共掃18層面。選擇避開鼻竇氣腔及側(cè)腦室、清晰顯示基底核的掃描層面作為目標(biāo)注血層面（ScanN）。測量左/右基底核皮質(zhì)目標(biāo)血腫部位（C）距基線的垂直距離（F）、中線矢狀縫（B）旁開的距離（L）和進(jìn)針深度（D）。測量后采用參數(shù)：F：21.5～23.5 mm，L：10.0～11.5 mm，D：19.0～21.0 mm。③立體定向和鉆顱：犬俯臥于手術(shù)臺(tái)上，頭固定于金屬頭架，鎖緊耳棒和門齒鉤。消毒、鋪巾。以左/右耳棒所在平面為基準(zhǔn)零平面，在定器上固定外徑1 mm的硬膜外麻醉穿刺針并使該針其重合于該平面。轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋鈕，讓穿刺針沿著矢狀縫前移22.5 mm，然后轉(zhuǎn)動(dòng)平移11 mm，此時(shí)針尖所在處即為穿刺點(diǎn)，用龍膽紫標(biāo)記后移開定向器，以標(biāo)記進(jìn)針點(diǎn)為中心，沿前后方向切開長約2～2.5 cm的皮膚切口，全層切開頭皮直至顱骨，向兩側(cè)牽開暴露骨面。啟動(dòng)鉆頭為2 mm的電動(dòng)顱鉆鉆透顱骨，達(dá)硬膜時(shí)有落空感。撤除顱鉆，無菌紗布暫時(shí)覆蓋傷口。④取血和注血：犬下肢側(cè)臥，充分暴露大腿根部，剪毛、消毒，于股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)處，用5 mL注射器（針頭呈30°進(jìn)針）先取新鮮股動(dòng)脈血4 mL（不抗凝），立即插入固定在立體定向器上穿刺針穿刺針上，選用硅膠注射器輕推1 mL以排盡氣泡或氣血混合液。定向器移回原來的定向穿刺位置，固定定向器，轉(zhuǎn)動(dòng)垂直移動(dòng)旋鈕，使穿刺針的針尖由頭皮向顱內(nèi)進(jìn)針20 mm，將不含氣體的3 mL新鮮股動(dòng)脈血用微量泵緩慢勻速注入目標(biāo)血腫區(qū)，注血時(shí)間5 min，注血壓力＜100 mmHg（1 mmHg= 0.133 kPa）。注血完畢后留針10 min。拔針后迅速用骨蠟封骨孔。生理鹽水及慶大霉素沖洗切口后，逐層縫合，無菌紗布包扎傷口。青霉素80萬U肌肉注射，預(yù)防感染。

1.3 評(píng)估指標(biāo)

1.3.1 于各時(shí)間點(diǎn)按注血前的位置、參數(shù)和方法復(fù)查CT，觀察目標(biāo)血腫區(qū)的高信號(hào)改變、血腫周圍腦水腫以及有無硬膜下血腫、側(cè)腦室積血。采用多田氏公式計(jì)算血腫和水腫體積及水腫比值（血腫體積/水腫體積）。

1.3.2 使用Array 360全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)采用免疫散射比濁法檢測各時(shí)間點(diǎn)外周靜脈血和/或血腫液中補(bǔ)體C3、 C4含量。取待測血清200 μL加樣，使用Array 360免疫化學(xué)分析系統(tǒng)及配套試劑自動(dòng)分析完成。水腫腦組織免疫組化染色采用SABC法：石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H2O2甲醛溶液中15 min，浸入0.01 mol/L、pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至95℃，成適當(dāng)濃度混懸液。一抗為羊抗人C3、C4多克隆抗體（滴度1∶5 000），進(jìn)行免疫組化染色和DAB顯色。

1.3.3 采用Purdy PD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估神經(jīng)功能缺損：于術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d，對(duì)腦出血模型犬的意識(shí)、行為、轉(zhuǎn)頭、轉(zhuǎn)圈及偏盲五方面進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。總得分最低分為2分，表示完全正常，無神經(jīng)功能缺陷；總得分最高分為11分，表示動(dòng)物意識(shí)喪失或死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢查

影像組和血腫組在基底核皮質(zhì)的目標(biāo)血腫區(qū)均有高密度陰影（圖1）。按多田氏公式計(jì)算血腫體積為（2.75±0.45）mL，血腫形態(tài)：類圓形或橢圓形15個(gè)，不規(guī)則形3個(gè)，條帶形2個(gè)。

圖1 術(shù)后6 h（A）、24 h（B）犬ICH后冠狀位CT

2.2 C3、C4含量檢測

影像組和血腫組外周血、血腫液補(bǔ)體C3、C4含量在術(shù)后6 h開始升高，至72 h達(dá)高峰，5 d時(shí)較72 h有所下降，7 d后降得更低。影像組、血腫組與正常對(duì)照組比較，術(shù)后6 h外周血C4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），其余同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見表1。

表1 3組犬外周血及血腫液補(bǔ)體C3、C4含量及水腫比值比較（±s）

表1 3組犬外周血及血腫液補(bǔ)體C3、C4含量及水腫比值比較（±s）

注：正常對(duì)照組、影像組測量外周血；影像組還測量水腫比值；與正常對(duì)照組比較，①＜0.05；與6 h比較，②＜0.05；與24 h比較，③＜0.05；與72 h比較，④＜0.05；與5 d比較，⑤＜0.05；與7 d比較，⑥＜0.05

組別 只數(shù) 6 h 24 h 72 h 5 d 7 d C3/（g/L）正常對(duì)照組 2 0.70±0.15 0.70±0.13 0.70±0.15 0.70±0.17 0.70±0.14影像組 2 0.80±0.12①③④⑤⑥ 1.00±0.14①②④⑤⑥ 1.51±0.18①②③⑤⑥ 1.18±0.14①②③④⑥ 0.99±0.13①②③④⑤血腫組 2 0.79±0.18①③④⑤⑥ 1.17±0.15①②④⑤⑥ 1.65±0.16①②③⑤⑥ 1.03±0.15①②③④⑥ 0.81±0.13①②③④⑤C4/（g/L）正常對(duì)照組 2 0.14±0.04 0.14±0.03 0.14±0.04 0.14±0.04 0.14±0.03影像組 2 0.14±0.05 0.19±0.04①②④⑤⑥ 0.33±0.08①②③⑤⑥ 0.24±0.05①②③④⑥ 0.20±0.05①②③④⑤血腫組 2 0.14±0.04 0.16±0.05①②④⑤⑥ 0.36±0.07①②③⑤⑥ 0.20±0.06①②③④⑥ 0.17±0.03①②③④⑤水腫比值影像組 2 0.34±0.15 0.59±0.16 1.08±0.19 0.87±0.16 0.73±0.16

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

影像組術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d，Purdy PD評(píng)分分別為（5.68±1.57）、（6.34± 1.54）、（8.95±1.25）、（4.88±1.25）、（3.58± 1.47）分；血腫組術(shù)后6 h、24 h、72 h、5 d、7 d，Purdy PD評(píng)分分別為（5.26±1.83）、（6.50±1.39）、（8.77±1.42）、（4.47±1.53）、（3.64±1.23）分。影像組、血腫組均出現(xiàn)與血腫部位相對(duì)應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征，其中運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)為血腫對(duì)側(cè)下肢癱瘓或以下肢癱為主的對(duì)側(cè)偏癱，意識(shí)狀態(tài)表現(xiàn)為清醒、嗜睡和昏睡，無昏迷或死亡。正常對(duì)照組無特殊變化，Purdy PD評(píng)分為（2.35±0.40）分。影像組和血腫組各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、變性疾病、腦血管疾病中都有補(bǔ)體激活，并參與病理生理過程[1-4]。血漿中的補(bǔ)體蛋白主要由肝細(xì)胞分泌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)補(bǔ)體蛋白主要由膠質(zhì)細(xì)胞釋放[5,6]。測定補(bǔ)體C3、C4即可充分反映補(bǔ)體的活化及功能狀態(tài)[7]。

正常情況下，腦內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)與補(bǔ)體抑制處于動(dòng)態(tài)平衡，故不發(fā)生病理損傷反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)ICH后犬外周血中補(bǔ)體C3、C4在術(shù)后6 h較正常對(duì)照組升高較少，可能是因?yàn)镮CH初期，血腦屏障破壞，補(bǔ)體成分進(jìn)入血腫周圍組織，補(bǔ)體成分消耗，此時(shí)自身免疫系統(tǒng)生成補(bǔ)體的速度比消耗慢，組織損傷較輕，腦水腫較輕，CT水腫比值較低。24 h后自身免疫系統(tǒng)被充分調(diào)動(dòng)，72 h達(dá)高峰，此時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分值升高達(dá)峰值，組織損傷最嚴(yán)重，腦水腫也達(dá)高峰，CT水腫比值明顯升高。自身補(bǔ)體成分的損害也激活了機(jī)體的自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)，以糾正生成過多的補(bǔ)體，第5天時(shí)的補(bǔ)體成分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分值有所下降，7 d時(shí)進(jìn)一步下降。由于血腦屏障已被破壞，水腫比值下降緩慢，第7天時(shí)水腫比值仍較高。ICH后，由于血腦屏障的破壞，血漿和中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原物髓鞘、磷脂、凝血酶、血紅蛋白均能激活腦內(nèi)補(bǔ)體，使補(bǔ)體C3、C4等形成催化作用的C3a等，引起免疫級(jí)鏈反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷。此外，通過破壞的血腦屏障，浸潤血腫周圍組織炎性細(xì)胞本身也具有合成及分泌補(bǔ)體的功能，進(jìn)一步加重腦損害。激活的補(bǔ)體能促進(jìn)肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)組織胺，破壞血腦屏障；還具有趨化因子作用，使大腦白細(xì)胞聚集，釋放溶酶體，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[8]。C3還可引起巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，進(jìn)一步加劇腦組織的病理損傷反應(yīng)[9]。Hua等[10]在大鼠ICH的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血腫周圍組織補(bǔ)體及激活后的過敏毒素明顯增加，同時(shí)補(bǔ)體抑制劑也相應(yīng)增加，但增加的幅度低于補(bǔ)體，使補(bǔ)體激活系統(tǒng)與抑制系統(tǒng)平衡破壞，導(dǎo)致免疫損傷。過度激活的補(bǔ)體系統(tǒng)成為腦缺血/再灌注二次損傷的重要原因。研究表明，補(bǔ)體激活后可對(duì)神經(jīng)元起細(xì)胞毒作用，加重腦組織的損害[11]。Huang等[12]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體激活抑制劑有神經(jīng)元保護(hù)作用，提示補(bǔ)體激活可能加重腦組織的損傷。至于補(bǔ)體激活加重腦組織損害的機(jī)制，可能與補(bǔ)體末端復(fù)合物的溶細(xì)胞作用有關(guān)。此外，近年來有一些研究提示，補(bǔ)體激活的一些中間產(chǎn)物似還參與神經(jīng)元的凋亡[11]，其機(jī)制還不清楚。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的基本標(biāo)志是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和白細(xì)胞的浸潤。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤的白細(xì)胞可釋放炎性因子[13]。炎性因子之間存在正反饋調(diào)節(jié)作用，引起神經(jīng)元損傷[14]。補(bǔ)體的激活和膜攻擊復(fù)合物的生成可破壞細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎性因子、自由基和MMPs等[10]。高表達(dá)的MMP-9可破壞血管基底膜并降解細(xì)胞外基質(zhì)，增加血管通透性，使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)入腦組織，導(dǎo)致腦水腫和腦組織損傷加重，而腦水腫和腦組織損傷導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤和炎性因子的進(jìn)一步釋放[15]。補(bǔ)體激活在ICH后腦水腫形成的病理生理過程中發(fā)揮了重要作用[16,17]，C3、C4激活是繼發(fā)性腦損害的重要因素[18,19]。Mocco等[20]報(bào)道，小鼠局灶性腦缺血后，C3缺陷小鼠可觀察到神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，梗死體積縮小34%，補(bǔ)體C3a受體拮抗劑可起到神經(jīng)保護(hù)作用。抑制補(bǔ)體C3、C4激活可能阻礙ICH后腦水腫程度及繼發(fā)性損害。

通過對(duì)家犬ICH動(dòng)物模型的研究，本研究發(fā)現(xiàn)ICH后家犬外周血、血腫液中補(bǔ)體C3、C4含量、水腫比值、腦水腫組織補(bǔ)體C3和C4的表達(dá)及神經(jīng)功能缺損評(píng)分值的動(dòng)態(tài)變化總的趨勢保持一致，補(bǔ)體激活與腦損傷、腦水腫程度時(shí)間上的相關(guān)性，表明補(bǔ)體C3、C4激活是ICH后血腫周圍腦水腫形成以及繼發(fā)性腦損害的重要因素，為臨床減輕ICH后腦水腫程度以及繼發(fā)性腦損害提供理論依據(jù)。

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Change of Complement C3 and C4 Levels in Dogs after Intracerebral Hemorrhage

Objective:To study the correlation between perihematomal edema and levels of complements C3 and C4 in intracerebral hemorrhage (ICH)dogs.Methods:Thirty dogs were randomly divided into normal control group,imaging group and hematoma group equally.The normal control group had received no treatment whereas the ICH model was established in both the imaging and hematoma groups by stereotactic injection of autologous anti-coagulated blood into the brain.The peripheral blood C3 and C4 contents in the control and imaging groups were measured respectively at 6 h,24 h,72 h,5 d,7 d after surgery,while head CT scan was performed and the ratio of edema were calculated at each time point.Neurological deficits were evaluated by the Purdy PD standard. Results:In the ICH dogs,the C3 and C4 levels in peripheral blood and hematoma liquid began to increase 6 h after ICH and reached the peak at 72 h,then decreased.The C4 level at 6 h in the imaging and hematoma groups showed no significant difference compared to the control group (＞0.05).However,at other time points investigated,the C3,C4 levels in the imaging and hematoma groups were significantly higher than those in the control group (＜0.05).Purdy PD score began to decrease after ICH,and further decline at 72 h,then gradually return to baseline.Conclusion:The activation of complements C3 and C4 may be involved in the cerebral edema formation around hematoma and secondary brain damage after ICH.

intracerebral hemorrhage;immunohistochemistry;C3;C4;brain edema

R741;R743.34

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.010

1.三臺(tái)縣人民醫(yī)院（川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院）神經(jīng)外科四川 綿陽 621100 2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科四川 瀘州646000

2013-08-19

姚慶寧txlint@163.com