黃夢陽，江紅，胡琦，康慧聰，許峰，劉曉艷，張存泰，朱遂強(qiáng)

低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃處理致中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷

黃夢陽a，江紅a，胡琦a，康慧聰b，許峰b，劉曉艷b，張存泰a，朱遂強(qiáng)b

目的：探討低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃致中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷的可能機(jī)制。方法：將50只老年雄性C57小鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組各25只，2組均給予連續(xù)灌胃12周，模型組灌注0.01 mL/g魚藤酮氯仿溶液，對(duì)照組灌注0.01 mL/g氯仿溶液。在灌胃前、灌胃6周、12周時(shí)對(duì)腸、胸段脊髓、中腦行α-突觸核蛋白（α-Syn）、硫磺素S（ThS）、酪氨酸羥化酶（TH）等免疫組化染色。灌胃12周時(shí)采用透射電鏡觀察2組黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：免疫組化染色提示灌胃6周時(shí)模型組小腸內(nèi)、胸段脊髓處α-Syn的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，且ThS表達(dá)比例增多，中腦處α-Syn及TH陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異（＞0.05）；灌胃12周時(shí)，模型組中腦α-Syn的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，TH陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少（=0.011）。灌胃12周后透射電鏡顯示模型組小鼠黑質(zhì)部可見細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不規(guī)則腫脹，細(xì)胞核形態(tài)各異，部分神經(jīng)元溶解壞死，數(shù)目減少，對(duì)照組未見明顯改變。結(jié)論：持續(xù)魚藤酮灌胃可能首先在小腸神經(jīng)叢局部形成α-Syn多聚體，再通過類朊蛋白途徑沿著神經(jīng)傳導(dǎo)通路播散至腦內(nèi)而導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元損傷。

帕金森??；魚藤酮；α-突觸核蛋白；多巴胺能神經(jīng)元

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，經(jīng)典病理改變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元（dopaminergic neuron，DN）變性丟失，殘留神經(jīng)元出現(xiàn)以α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）為主要成分的Lewy小體[1]。近年臨床研究提示PD病理改變可能首先從胃腸神經(jīng)節(jié)[2]、脊髓[3]等處出現(xiàn)，再逐漸播散至中腦等處。與此同時(shí)，國外研究提示低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃可導(dǎo)致中腦DN的損傷和減少[4]，而目前國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬予老年小鼠持續(xù)魚藤酮灌胃處理，并在多水平對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行病理和超微結(jié)構(gòu)研究，以初步探討魚藤酮持續(xù)灌胃后DN損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12月齡清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量約28 g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）2008-0004。

1.1.2 主要試劑 魚藤酮、半胱氨酸、硫磺素 S（Thioflavin S，ThS）均購自美國Sigma公司；氯仿購自天津市化學(xué)試劑公司；羧甲基纖維素購自上海KaYon生物科技有限公司；乙醇和10%水合氯醛由武漢同濟(jì)醫(yī)院提供；抗α-Syn抗體購自美國Santa Cruz公司，抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體購自美國Chemicon公司。魚藤酮溶液的配制：將魚藤酮粉末溶于 12.5%氯仿，配制成50 mg/mL魚藤酮溶液，20℃避光保存，灌胃時(shí)再將魚藤酮氯仿溶液與2%羧甲基纖維素溶液攪拌混勻，每只小鼠的魚藤酮?jiǎng)┝繛? mg/kg，溶液體積為0.01 mL/g。同時(shí)，將氯仿、2%羧甲基纖維素按上述比例配制成空白對(duì)照溶液。

1.2 方法

1.2.1 灌胃處理 取小鼠50只，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組各25只，每周灌胃5 d，休息2 d，均連續(xù)灌胃12周。模型組給予灌注0.01 mL/g魚藤酮氯仿溶液，對(duì)照組則灌注0.01 mL/g的空白對(duì)照溶液。

1.2.2 免疫組化染色 對(duì)灌胃前、灌胃6周、12周小鼠（各3只）的腸、胸段脊髓、中腦行α-Syn免疫熒光及硫磺素染色：將小鼠用10%水合氯醛灌注，后斷頭，取空腸、胸段脊髓和腦，并置于4%多聚甲醛中在4℃后固定6 h，脫水、石蠟包埋、切片，行α-Syn免疫熒光染色，其后用50%酒精新鮮配制 0.05%ThS溶液孵育切片10～20 s，再分別用50%酒精、70%酒精各沖洗1次，每次5 min，最后加50 μg/mL的DAPI避光孵育15 min。同時(shí)，對(duì)兩組小鼠中腦行TH免疫熒光染色。

1.2.3 TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 切片染色后熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)腦組織包塊選5張連續(xù)切片觀察黑質(zhì)部分。每張切片先在低倍鏡下選取TH陽性細(xì)胞密集區(qū)，然后在高倍鏡下隨機(jī)選取2個(gè)視野進(jìn)行TH陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)，對(duì)10個(gè)視野下所有陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出平均值。

1.2.4 電鏡觀察 灌胃12周（各2只）模型組和對(duì)照組在灌注固定后，取黑質(zhì)約0.5 mm3，2.5%戊二醛、1%鋨酸鉛雙重固定，脫水，Epon812包埋，LKB-Ⅲ切片機(jī)超薄切片，醋酸鈾硝酸鉛雙重染色，IEM-1200EX透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 2組腸道和脊髓免疫熒光

2 結(jié)果

2.1 2 組免疫組化染色

灌胃前2組小鼠小腸、胸段脊髓及中腦均可見α-Syn的表達(dá)，未見明顯差異；灌胃6周后模型組小腸、胸段脊髓處α-Syn的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，且ThS表達(dá)比例也明顯增多，見圖1，中腦黑質(zhì)處α-Syn及TH陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)均無明顯差異；灌胃12周后，模型組中腦黑質(zhì)處α-Syn的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，TH陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少，見圖2，模型組小腸、胸段脊髓處α-Syn的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加。

圖2 2組灌胃12周后中腦黑質(zhì)免疫熒光（×400）

2.2 TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

模型組灌胃前、灌胃6周及12周后TH陽性細(xì)胞分別為（25.60±3.03）個(gè)、（24.40±5.86）個(gè)、（18.80±2.35）個(gè)，對(duì)照組灌胃前、灌胃6周及12周后TH陽性細(xì)胞分別為（26.70±3.30）個(gè)、（25.10±4.73）個(gè)、（22.40±3.24）個(gè)。灌胃前及灌胃6周后模型組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；灌胃12周后，模型組較對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.011）。

2.3 電鏡結(jié)果

灌胃12周后模型組小鼠的黑質(zhì)部可見細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不規(guī)則腫脹，細(xì)胞核形態(tài)各異，部分神經(jīng)元發(fā)生溶解壞死，數(shù)目減少；對(duì)照組小鼠的大部分黑質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核形狀正常，細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯異常，見圖3。

圖3 灌胃12周2組中腦黑質(zhì)超微病理

3 討論

PD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，臨床常表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)癥狀，經(jīng)典病理改變?yōu)橹心XDN變性丟失，但其發(fā)病機(jī)制現(xiàn)仍尚未完全明確。近年越來越多的臨床研究顯示PD患者在運(yùn)動(dòng)癥狀前常出現(xiàn)嗅覺減退[5]、抑郁[6]、睡眠障礙[7]等非運(yùn)動(dòng)癥狀。Braak等[8]的神經(jīng)病理研究也證實(shí)，PD患者體內(nèi)路易小體最初多始于嗅球等，后才逐漸進(jìn)展至中腦和皮質(zhì)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)。同時(shí)對(duì)接受胚腦移植10余年的PD患者進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)的胚腦多巴胺能神經(jīng)元形成新的路易小體[9]；將綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植入表達(dá)人α-Syn的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，4周后約15%的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)人α-Syn[10]。因此，上述證據(jù)提示α-Syn有可能先在胃腸神經(jīng)節(jié)或嗅球等處形成寡聚體、多聚體等異常聚集體，而異常聚集體可再進(jìn)入臨近神經(jīng)元并誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)α-Syn單體形成新的異常聚集體，進(jìn)而通過此類朊蛋白機(jī)制導(dǎo)致PD病情的進(jìn)展[11]。

為驗(yàn)證此類朊蛋白機(jī)制的可能，Pan-Montojo等[4]采取低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃的方法處理老年小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中腦DN出現(xiàn)損傷和減少，行為學(xué)也呈現(xiàn)相應(yīng)的改變，然而該P(yáng)D模型目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。為此筆者嘗試對(duì)C57老年小鼠進(jìn)行持續(xù)灌注魚藤酮，并對(duì)中腦神經(jīng)元進(jìn)行超微病理研究，透射電鏡結(jié)果顯示黑質(zhì)部神經(jīng)元的細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不規(guī)則腫脹，細(xì)胞核形態(tài)各異，部分神經(jīng)元發(fā)生溶解壞死，且數(shù)目明顯減少。同時(shí)，免疫組化結(jié)果顯示魚藤酮灌胃6周后α-Syn僅在小腸神經(jīng)叢、胸段脊髓表達(dá)增加，至12周時(shí)才出現(xiàn)中腦α-Syn表達(dá)增加，并伴有中腦DN的減少，即隨著魚藤酮灌胃時(shí)間的增加，α-Syn在小腸神經(jīng)叢、胸段脊髓和中腦的表達(dá)依次增多，最后才出現(xiàn)中腦DN的減少。

因此，經(jīng)低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃處理后的老年小鼠表現(xiàn)出以下病理學(xué)特征：α-Syn聚集和神經(jīng)元死亡由胃腸道神經(jīng)叢逐漸播散至中腦黑質(zhì)。為排除該劑量的魚藤酮吸收入血后透過血腦屏障導(dǎo)致DN的損傷，Pan-Motonjo等[4]采用高效液相色譜法檢測模型組小鼠血和腦標(biāo)本，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)魚藤酮成分，而且對(duì)腦內(nèi)線粒體復(fù)合酶Ⅰ進(jìn)行檢測也未見改變。同時(shí)，在截?cái)噙B接腦干和胃腸道的迷走神經(jīng)干后再對(duì)小鼠持續(xù)灌注魚藤酮，中腦則未再出現(xiàn)上述改變[12]。因此，上述中腦α-Syn異常表達(dá)和多巴胺能神經(jīng)元的損傷和減少有可能是小腸神經(jīng)叢局部的α-Syn多聚體通過類朊蛋白途徑沿神經(jīng)傳導(dǎo)通路播散至中腦所致[13,14]。然而，魚藤酮具有高度親脂性，易穿過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，故還需更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步排除魚藤酮直接到達(dá)腦內(nèi)的可能。

因此，小劑量魚藤酮持續(xù)灌胃后導(dǎo)致中腦DN損傷的現(xiàn)象初步提示了類朊蛋白途徑存在的可能，并為研究PD發(fā)病機(jī)制和篩選延緩PD進(jìn)展的藥物提供了良好的模型，但仍需要更多的實(shí)驗(yàn)來重復(fù)證實(shí)，且DN損傷的詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Dopaminergic Neuron Damage induced by Constant Intragastric Administration of Low-dose Rotenone

Objective:To explore the mechanism of dopaminergic neuron damage induced by constant intragastric administration of low-dose rotenone.Methods:Fifty aged male mice were randomly divided into Parkinson disease(PD)model group and control group.The mice in PD model group were administrated 0.01 mL/g rotenone by gavage while the mice in control group were administrated 0.01 mL/g chloroform.Before treatment and 6 weeks,as well as 12 weeks after treatment,alpha-synuclein(α-Syn),Thioflavin S(ThS)and tyrosine hydroxylase (TH)were detected in neurons from gastrointestinal tract,thoracic spinal cord and midbrain of both the control and treated animals.Simultaneously,ultrastructural changes were observed by electron microscopy 12 weeks after treatment.Results:Six weeks after treatment,immunofluorescence demonstrated that α-Syn and ThS were increased in intestinal intramural plexus and thoracic spinal cord in the PD model group compared to the controls while the expression of α-Syn and number of TH positive neurons in midbrain did not show any significant changes(＞0.05).However,12 weeks after treatment,immunofluorescence showed that there was an increase in α-Syn and an significant decrease in TH positive neurons in the midbrain(=0.011)in the model group compared with those in the controls.Moreover,electron microscopy showed a lot of abnormalities in the PD model group, such as the swollenness of cell membrane,mitochondria and endoplasmic reticulum,alterations of nuclei,and necrosis of neurons in the substantia nigra,in a sharp contrast to the normality in the.control group.Conclusion: Dopaminergic neuron damage was observed in mouse brain after constant intragastric administration of low-dose rotenone,probably mediated by the spread of synuclein aggregates formed in gastrointestinal plexues into brain by prion-like transmission.

Parkinson's disease;rotenone;alpha-synuclein;dopaminergic neuron

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.008

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院a.綜合科 b.神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

國家自然科學(xué)基金青年基金（No.81102689）

2014-02-24

胡琦huqi@hotmail.com