趙慧新，趙鋼勇，張平

移植腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對AD大鼠的影響

趙慧新1，趙鋼勇2，張平1

目的：研究移植腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體1（NMDAR1）及認(rèn)知功能的影響。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)平均分為正常對照組、假手術(shù)組、AD組、MSCs組、BDNF組。正常對照組不予任何處理，其他4組制備AD模型；MSCs組和BDNF組于制模第11天分別注入10 μL（約5×106）MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF轉(zhuǎn)染的MSCs。采用Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化染色法測定NMDAR1水平。結(jié)果：MSCs組、BDNF組與AD組比較平均逃避潛伏期（AEL）明顯縮短、跨平臺次數(shù)顯著增加；BDNF組較MSCs組改善更顯著（＜0.01），NMDAR1水平更高（＜0.01）。結(jié)論：BDNF轉(zhuǎn)染骨髓MSCs對AD大鼠的認(rèn)知有改善作用，且促進(jìn)海馬區(qū)NMDAR1的表達(dá)。

阿爾茨海默??；N-甲基-D-天冬氨酸受體；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是由于膽堿能神經(jīng)元受損，導(dǎo)致進(jìn)行性認(rèn)知障礙和行為損害。雖然目前治療該病的藥物如膽堿能制劑等可緩解癥狀，但還沒有確定的有效逆轉(zhuǎn)認(rèn)知障礙的藥物。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是興奮性氨基酸谷氨酸的特異性受體，是涉及情緒行為、學(xué)習(xí)記憶等腦功能的關(guān)鍵物質(zhì)。以往研究結(jié)果顯示，AD大鼠側(cè)腦室內(nèi)移植轉(zhuǎn)染腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可改善AD大鼠認(rèn)知[1]。本實(shí)驗(yàn)通過向AD大鼠側(cè)腦室內(nèi)移植骨髓MSCs及轉(zhuǎn)染BDNF的骨髓MSCs，觀察治療后AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善情況，并測定治療干預(yù)后的AD大鼠海馬區(qū)NMDAR必需功能亞基NMDAR1的水平[2]，研究移植BDNF轉(zhuǎn)染的骨髓MSCs對AD大鼠NMDAR1及認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2～3周齡健康SD大鼠50只，雌雄不限，體質(zhì)量80～120 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 Aβ25-35（購于美國Sigma公司），質(zhì)粒pIRESneo-EGFP-BDNF由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]，NeuroPORTERTM轉(zhuǎn)染試劑（購于美國GTS公司），HRP標(biāo)記抗兔抗體（購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗鼠NMDAR抗體（購于美國Santa Cruz公司）。電轉(zhuǎn)染儀（購于美國Bio-Rad公司），DW2000腦立體定位儀及Morris水迷宮（購于成都泰盟科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓 MSCs培養(yǎng)及 pIRESneo-EGFP-BDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓MSCs大鼠頸椎脫臼處死后于無菌條件下分離股骨、脛骨，用含10%血清的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)，換液，細(xì)胞生長接近融合時傳代培養(yǎng)。pIRESneo-EGFP-BDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓MSCs：取第3或5代骨髓MSCs進(jìn)行胰酶消化[4]，用含血清培養(yǎng)基終止消化后，500 rpm 離心 5 min，質(zhì)粒 pIRESneo-EGFP-BDNF電轉(zhuǎn)染（電壓280 V，20 ms）后培養(yǎng)48 h，換為15%FBS培養(yǎng)基（含100 μg/mL G418）進(jìn)行篩選，2～3 d換液，篩選 10～14 d，去除 G418，用含 15% FBSDMEM培養(yǎng)5～7 d，于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)，見圖1。

1.2.2 動物模型制作及分組 50只大鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組、假手術(shù)組、AD組、MSCs組、BDNF組，每組各10只。以制備AD模型為制模第1天，正常對照組不予任何處理，其他4組制備AD模型：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于腦立體定位儀上固定頭部，暴露頂骨，參照大鼠腦圖譜[5]，選擇前囟后3.5 mm、中線兩側(cè)旁開2 mm為穿刺點(diǎn)，微量注射器垂直進(jìn)針達(dá)硬膜下3 mm（海馬CA1區(qū)），假手術(shù)組注射生理鹽水，其他3組均注射Aβ25-35（用生理鹽水稀釋成2 μg/μL），兩側(cè)均為5 μL，注射時間20 min，留針5 min，2次注射間隔10 min。注射完畢后退針，縫合皮膚。MSCs組和BDNF組于制模第11天，定位左側(cè)腦室，于前囟后1.0 mm，中線左側(cè)旁開1.5 mm為穿刺點(diǎn)，垂直進(jìn)針達(dá)硬膜下4.0 mm，MSCs組和BDNF組分別注入10 μL（約5×106）MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF轉(zhuǎn)染的MSCs，注射時間15 min，留針10 min。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測試 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6]：①定位航行試驗(yàn)：在制模第16天開始，將大鼠面向池壁放入水中，從入水點(diǎn)到發(fā)現(xiàn)并爬上水下平臺的時間，為逃避潛伏期（escape latency，EL）。連續(xù)訓(xùn)練4次，每次間隔60 s，4次EL的平均值為平均逃避潛伏期 （average escape latency，AEL）。②空間探索試驗(yàn)：經(jīng)過5 d定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練，于制模第21天將水下平臺移走，大鼠由任一入水點(diǎn)下水，在120 s內(nèi)通過原水下平臺位置的次數(shù)為跨平臺次數(shù)，取4次記錄的平均值。

1.2.4 NMDAR1免疫組化檢測方法 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦，留取含海馬的腦段，4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h，脫水石蠟包埋，制成5 μm的冠狀切片，免疫組織化學(xué)染色SP法檢測NMDAR1：常規(guī)脫蠟和水化，0.3%甲醇-過氧化氫室溫孵育，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液微波爐內(nèi)修復(fù)，10%山羊血清封閉，加入一抗37℃溫箱濕盒孵育30 min，滴加生物素化二抗37℃溫箱濕盒孵育15 min，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。陰性對照用PBS替代一抗，余步驟同上。每只大鼠取3張海馬CA1區(qū)的NMDAR1免疫組化染色切片，用顯微鏡目測器對NMDAR1陽性細(xì)胞計數(shù)，每張切片的每個測定部位隨機(jī)選5個視野，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮結(jié)果

制模第1～5天，與AD組比較，MSCs組、BDNF組AEL有顯著性差異（＜0.01）；與MSCs組比較，BDNF組AEL有顯著性差異（＜0.01）；制模第1、2天，與假手術(shù)組比較，BDNF組AEL有顯著性差異（＜0.01）；制模第3～5天，BDNF組與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（＞0.05），見圖2。與對照組和假手術(shù)組比較，AD組和MSCs組跨平臺次數(shù)有顯著性差異（＜0.01），BDNF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與AD組和MSCs組比較，BDNF組跨平臺次數(shù)有顯著性差異（＜0.01），見圖3。

圖1 pIRESneo-EGFP-BDNF電轉(zhuǎn)染后的骨髓MSCs（×400）

2.2 NMDAR1免疫組化結(jié)果

正常對照組、假手術(shù)組、AD組、MSCs組及BDNF組NMDAR1免疫陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量分別為（30.27±2.98）、（28.43±4.63）、（13.60±2.53）、（22.53± 3.36）、（26.35±2.28）個，與正常對照組比較，AD組、MSCs組、BDNF組有顯著性差異（＜0.01）；與假手術(shù)組比較，AD組、MSCs組有顯著性差異（＜0.01）；與AD組比較，MSCs組、BDNF組有顯著性差異（＜0.01）；與MSCs組比較，BDNF組有顯著性差異（＜0.01），見圖4。.

圖2 5組大鼠定位航行試驗(yàn)AEL比較

圖3 5組大鼠跨平臺次數(shù)比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)顯示AD組AEL較假手術(shù)組及正常對照組均延長，且跨平臺次數(shù)均減少，有顯著性差異（＜0.01），認(rèn)為AD模型成功。MSCs組及BDNF組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)成績均好于AD組大鼠，即側(cè)腦室內(nèi)給予骨髓MSCs及轉(zhuǎn)染BDNF的骨髓MSCs治療干預(yù)后的AD大鼠認(rèn)知障礙均有改善，且BDNF基因修飾的骨髓MSCs對AD大鼠治療效果更顯著。

BDNF主要分布在海馬及大腦皮質(zhì)[7]，是神經(jīng)元產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅促進(jìn)發(fā)育期神經(jīng)元存活、生長、分化，且調(diào)節(jié)成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞及突觸可塑性，改善記憶等認(rèn)知功能[8]。以往研究證實(shí)AD患者BDNF水平下降[9]，且動物實(shí)驗(yàn)表明腦室內(nèi)注射BDNF抗體導(dǎo)致大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降[10]，因此可否通過給予BDNF改善AD認(rèn)知障礙成為研究熱點(diǎn)。由于BDNF不能透過血腦屏障，因此多采取將BDNF基因轉(zhuǎn)染骨髓MSCs后注入側(cè)腦室進(jìn)行移植的方法[11]。本實(shí)驗(yàn)中BDNF組認(rèn)知障礙改善最明顯，再次證實(shí)BDNF可改善AD的認(rèn)知。具體機(jī)制并不明確，近年研究表明BDNF在海馬的突觸可塑性和記憶中發(fā)揮重要作用可能是通過增強(qiáng)NMDAR表達(dá)[12]。

NMDAR是一種配體電壓雙重門控型離子通道受體，為興奮性氨基酸谷氨酸受體，介導(dǎo)興奮性突觸傳遞，通過結(jié)合谷氨酸使膜兩側(cè)鈉、鉀、鈣通透性升高，產(chǎn)生興奮性突觸后電位。NMDAR改善學(xué)習(xí)記憶能力是通過依賴性長時程增強(qiáng)過程觸發(fā)下游的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)[13]，影響突觸可塑性和行為，有助于神經(jīng)功能的代償和恢復(fù)。NMDAR與AD有重要的關(guān)系[14]。NMDAR包括NMDAR1和NMDAR2兩個亞基，NMDAR1為必需功能亞基[2]，故NMDAR1可反映NMDAR水平。本實(shí)驗(yàn)顯示MSCs組和BDNF組大鼠海馬區(qū)NMDAR1表達(dá)均高于AD組，且認(rèn)知改善最明顯的BDNF組大鼠海馬區(qū)NMDAR1水平更高，提示移植BDNF轉(zhuǎn)染骨髓MSCs促進(jìn)AD大鼠NMDAR1的表達(dá)，推測BDNF可能通過促進(jìn)骨髓MSCs的存活及其他機(jī)制，最終促使NMDAR1表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果同時提示AD大鼠認(rèn)知障礙的改善可能與海馬區(qū)NMDAR1表達(dá)水平升高有關(guān)，且文獻(xiàn)報道目前研究較熱的合成類促智藥物Sunifiram即可能通過NMDAR來改善認(rèn)知[15]。NMDA過度活化NMDAR也可導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷[16]。

本實(shí)驗(yàn)顯示移植BDNF轉(zhuǎn)染骨髓MSCs對AD大鼠的認(rèn)知有改善作用，且促進(jìn)海馬區(qū)NMDAR1的表達(dá)，為進(jìn)一步尋找治療AD的有效措施提供了理論依據(jù)。

圖4 正常對照組（A）、假手術(shù)組（B）、AD組（C）、MSCs組（D）及BDNF組（E）大鼠NMDAR1免疫陽性神經(jīng)細(xì)胞（免疫組化SP染色，×400）

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Effect of Transplantation of Bone Mesenchymal Stem Cells transfected with BDNF on Alzheimer Disease Rats

Objective:To study the changes of N-methyl-D-aspartate receptor 1 (NMDAR1)and learning and memory function after transplanting bone mesenchymal stem cells (MSCs)modified with brain-derived neurotrophic factor(BDNF)gene in brain of Alzheimer disease(AD)rats models.Methods:Fifty healthy SD rats were randomly divided into 5 groups with equal number in each group,groups normal,sham,AD,MSCs,and BDNF.The normal group had received no treatment;and the AD models were established in the other 4 groups. The MSDs and the BDNF groups were injected by 10 μL (about 5×106)MSCs or MSCs modified with BDNF gene respectively.The learning and memory abilities of the rats were evaluated with Morris water maze test.The expression of NMDAR1 was detected by immunohistochemistry.Results:The average escape latency(AEL)was significantly shorter and the frequency of crossing the platform was significantly increased in the MSCs and BDNF groups compared with those in the AD group.The rats in the BDNF group showed greater learning and memory function improvement and higher expression of NMDAR1 compared with those in the MSCs group(＜0.01).Conclusion:Bone MSCs modified with BDNF gene could improve the memory and learning of AD rats and up-regulate the expression of NMDAR1 in the hippocampus.

Alzheimer disease;N-methyl-D-aspartate receptor;bone mesenchymal stem cells;brain-derived neurotrophic factor

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.007

1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河北 保定 071000 2.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心河北 保定 071000

2013-09-17

張平huandeng2004@163. com