閔喆，李昌盛，方瑜，邱占東，張?zhí)K明

激光散斑成像技術在大鼠大腦中動脈栓塞模型側枝循環(huán)觀測中的應用

閔喆1，李昌盛2，方瑜1，邱占東1，張?zhí)K明1

目的：利用激光散斑成像（LSI）技術觀察大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型側枝循環(huán)開放情況及局部腦血流的變化。方法：成年雄性SD大鼠9只，使用改良線栓法制備永久性大腦中動脈栓塞（pMCAO）模型。利用LSI技術觀測術后90 min內缺血半球皮質血流變化及側枝循環(huán)開放情況，術后24 h TTC染色法觀察腦梗死體積。結果：造模成功后大鼠右側大腦半球皮質大腦中動脈供血區(qū)血流明顯減少，部分大鼠隨著側枝循環(huán)逐漸開放局部血流不同程度恢復，另一部分大鼠血流恢復緩慢。結論：LSI技術時間空間分辨率高，成像結果直觀。

大鼠；大腦中動脈栓塞；激光散斑成像；側枝循環(huán)

缺血性卒中后的腦血流變化是決定預后的重要因素。側枝循環(huán)的開放與建立對卒中后腦血流的代償與恢復具有十分重要的意義，其病理生理機制還需進一步揭示。大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是目前運用最為廣泛的局灶性腦缺血模型[1]，但也存在一些局限性，如能多大程度模擬人類缺血性卒中發(fā)病過程，及模型的穩(wěn)定性和均一性等問題。以往人們在MCAO模型的研究中對于血流變化和側枝循環(huán)情況關注得不夠，這也與缺乏良好的觀測手段有關。隨著激光散斑成像（laser speckle imaging，LSI）技術在血流監(jiān)測中運用的日趨成熟，使較直觀地實時觀察腦血流變化成為可能[2]。本研究利用LSI技術觀察一種改良的大鼠大腦中動脈永久性栓塞（permanent MCAO，pMCAO）模型側枝循環(huán)開放和局部血流再分布情況，并通過回顧和比較以往的類似研究結果來分析其成像特點和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠9只，體質量240～280 g，購自湖北省實驗動物中心。

1.1.2 主要儀器 激光血流成像系統(tǒng)，由華中科技大學國家光電實驗室生物醫(yī)學光子學研究部提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠pMCAO模型的建立 ①顱骨磨薄：參考文獻[3]，用微型電鉆將位于右側顱頂部的觀察區(qū)域顱骨均勻磨薄，不將顱骨磨穿并保持硬腦膜完整，形成一個前至前囟，左至矢狀縫，右至右側顳線，后至冠狀縫的近似矩形的觀測窗（圖1）。②pMCAO模型制備：顱骨觀測窗磨薄完成后立即開始造模，參照文獻[4]的線栓法并加以改良，采用頭端均勻包裹硅橡膠的釣魚線作為栓子制備大鼠右側pMCAO模型，過程中使用反饋式動物體溫維持儀將大鼠直腸溫度控制在（37.0±0.5）℃。

1.2.2 LSI分別于造模前、造模后15 min及造模后90 min在LSI系統(tǒng)下觀察血流及側枝循環(huán)情況。觀測過程中將激光均勻照射在觀測區(qū)域上，觀測區(qū)域的散射光信號由連接在體視顯微鏡上的CCD采集。原始圖像通過實時血流運算法[5]處理直接轉換為流速信息，每隔20 ms獲得一幀原始圖像，連續(xù)成像150幀，即每隔30 s獲取一張腦血流分布圖，每個時間點獲得15張腦血流分布圖進行分析。

1.2.3 TTC染色及梗死體積計算 大鼠造模后24 h斷頭處死取腦，腦組織在4℃生理鹽水中漂洗，－20℃冰凍15 min后作冠狀切片，片厚約2 mm，每個腦組織共切8片。將腦片置于pH7.4、0.01 mmol/L PBS配制的1%TTC溶液中，37℃孵育30 min后，10%多聚甲醛固定，數(shù)碼相機拍攝照片。

2 結果

2.1 大鼠pMCAO模型的皮質血流變化

4只典型造模大鼠（分別命名為鼠A、鼠B、鼠C、鼠D）不同時間點的血流變化情況有相同點（圖2），造模后右側大腦半球皮質血流均出現(xiàn)下降，且以大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）供血區(qū)（約為觀測區(qū)的下2/3區(qū)域）下降最明顯（圖2鼠C）。不同大鼠之間血流變化存在一定差異。造模后15 min血流下降達峰值，90 min時局部血流不同程度恢復，但部分大鼠血流恢復不明顯（圖2鼠A）。另有1只大鼠造模后血流下降不明顯（約為造模前的60%），且90 min時血流恢復到造模前的約80%，提示可能造模失敗（圖2鼠D）。

圖1 顱骨磨薄示意圖

2.2 大鼠pMACO模型的側枝循環(huán)

以鼠B為例，在局部放大圖像上觀察造模后側枝循環(huán)情況（圖3）。本研究發(fā)現(xiàn)，直到造模后90 min，觀測區(qū)MCA發(fā)出的部分皮質分支結構仍然完整，并未完全塌陷，在“白光圖”上仍可見血管結構，但在散斑圖像上其血流已幾乎陷于停滯（圖3，造模后90 min時“白光圖”中“O”所示樹杈狀血管影，在同時期的兩種散斑圖上已幾乎不顯影）。此外，由于靜脈管徑較粗且靜脈血顏色較深，因此在“白光圖”中靜脈（圖3中“V”所示血管）顯示較為突出，但實際上其血流速度比動脈慢，相比于“白光圖”，LSI可較好地反映血流速度的變化。MCAO造模后，大鼠自發(fā)開放的側枝循環(huán)主要存在于大腦前動脈（anterior cerebral artery，ACA）與MCA分支之間，二者之間的吻合血管在正常情況下廣泛存在，在造模后，一部分吻合支中血流方向發(fā)生逆轉，由ACA向MCA分支供血[6]（圖3中“▲”所示血管）。另一方面，部分由MCA分支發(fā)出流向ACA供血區(qū)的血管在造模后血流明顯下降并最終停滯（圖3“O”所示血管）。另一些在造模前未充盈的側枝則逐步開放（圖3“↖”所示血管），本研究中可見造模后15 min即可見側枝開放，到90 min時隨著開放側枝的增多，MCA供血區(qū)的血流得到不同程度恢復。

圖2 4只典型造模大鼠（鼠A，鼠B，鼠C和鼠D）不同時間點的皮質血流變化情況

2.3 大鼠pMCAO模型的梗死體積

TTC染色后，正常腦組織染成紅色，缺血腦組織呈白色（圖4）。本研究的9只造模大鼠中，除栓塞后血流下降不明顯且逐漸恢復的1只大鼠（鼠D）完全無梗死灶外，其余8只均出現(xiàn)不同程度的腦梗死，其中6只栓塞側大腦半球的皮質及皮質下出現(xiàn)較廣泛的梗死灶，另有2只大鼠梗死體積較小，僅出現(xiàn)皮質梗死而無皮質下梗死。

圖3 鼠B造模后側枝循環(huán)的局部放大圖像

圖4 大鼠pMCAO模型的梗死體積（TTC染色）

3 討論

MCAO模型是目前運用最為廣泛的腦梗死模型[1]，“血流決定命運”的腦梗死方程式是溶栓等治療有效的理論基礎[7]。LSI技術的產生為直觀研究腦梗死后血流變化及側枝形成機制提供了新的選擇。作為目前應用最廣泛的缺血性卒中動物模型，MCAO的具體造模方法有很多差異，結合本研究和文獻報道，筆者發(fā)現(xiàn)不同的栓塞造模方法制作的模型的側枝循環(huán)的特點有所不同。華中科技大學國家光電實驗室駱清銘團隊采用頭端包被賴氨酸的尼龍線作為栓子構建大鼠MCAO模型，并用LSI技術觀察造模后180 min的側枝循環(huán)情況，發(fā)現(xiàn)15 min時可觀察到較多細小側枝循環(huán)的開放，但隨著時間的推移，開放的側枝數(shù)量越來越少[8]。本研究采用的是頭端較長一段包裹硅橡膠的魚線作為栓子構建pMCAO模型，同樣在造模后15 min就觀察到側枝循環(huán)開放，不同的是觀察到90 min時開放的側枝數(shù)量較15 min時更多，這種差異可能是由于不同的栓子材料造成的，前者選擇的栓子前端較細，隨著栓子周圍血栓形成血流梗阻逐漸加重；本研究魚線經(jīng)過硅橡膠包裹后頭端較粗且具有較強彈性，可在第一時間較快阻斷血流，可能更接近臨床“腦栓塞”。另一方面，在觀察時間上，由于麻醉及實驗條件限制，為防止長時間成像造成大鼠的血壓及血氣明顯下降，本研究只觀測到90 min。在較早之前，Armitage等[9]采用類似介入的方法，利用微導管向大鼠MCA注入其自體血液塑造的凝血栓子，觀察造模前、造模后及24 h后的側枝情況，關注重點是MCA與ACA之間的較大吻合側枝。由于同樣是類栓塞模型，與本研究類似，他們也觀察到不同程度的“自發(fā)性再灌”現(xiàn)象。而上海交通大學童善保研究團隊[10]利用LSI技術發(fā)現(xiàn)MCAO模型早期腦血流與最終梗死面積之間存在線性關系，即血流灌注決定梗死灶大小，這一點似乎不言自明，但LSI技術用圖像和數(shù)據(jù)為之提供了較為直觀的證據(jù)。

與上述研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)ACA與MCA分支之間的吻合支在MCAO模型初期的側枝循環(huán)中起重要作用。因為新生血管的形成需要較長的時間，MCAO的最初幾小時甚至數(shù)十小時，側枝循環(huán)主要依靠固有吻合血管的血流再分布來實現(xiàn)。其中一部分較大的吻合支中血流方向發(fā)生逆轉，由ACA向MCA分支區(qū)供血，而另一部分較小分支則出現(xiàn)血流重新分布，其特點為：由MCA區(qū)（圖3下方）向ACA區(qū)（圖3上方）發(fā)出的樹杈狀（“Y”字型）吻合支逐漸閉合，而相反方向的（“人”字型）吻合支則逐步開放，這一現(xiàn)象符合血流動力學特點，因為當血流方向發(fā)生改變后，前者的血流阻力明顯高于后者。

另一方面，MCAO模型的自發(fā)再通或再灌現(xiàn)象也不容忽視，較完全的再灌會導致造模失敗，若不加控制甚至會影響實驗結論的有效性[11]。本研究中也出現(xiàn)了1例自發(fā)再通造成的造模失敗。再通可能是栓子過細造成的，也可能存在動物血管結構或生理變異的個體差異等原因。無論如何，在利用MCAO模型進行實驗的過程中進行血流監(jiān)測是必要的，而相對于傳統(tǒng)的激光多普勒血流儀，LSI技術可更為實時和直觀地監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)再通現(xiàn)象，便于及時補救（換栓子）或者舍（剔除）。同時，許多不同造模方法的MCAO模型都發(fā)現(xiàn)側枝循環(huán)及其他方面的先天性個體差異導致模型的不均一性，但是臨床患者的個體差異也是如此，與其過分苛求模型的均一性，不如提高實驗設計的科學性，在組內差異較大的情況下，適當提高樣本數(shù)量有時是必要的。實時監(jiān)測血流及側枝循環(huán)情況能幫助較快發(fā)現(xiàn)造模失敗和極端變異個體，提高實驗效率，有助于控制實驗質量。

LSI技術還存在一些技術限制，如：①大鼠顱骨較厚，若采取去骨瓣開顱窗則成像質量高，但破壞了血腦屏障，可能影響研究結果，而不開顱的顱骨磨薄技術保持了血腦屏障的完整性，但操作難度較大，若觀察窗不均勻則影響成像質量，且不利于長時間反復觀測。②動物皮質較淺表的血管血流變化較敏感，環(huán)境溫度、體溫、血壓及血氣控制十分必要，長時間觀測時更是如此。③單純的LSI技術只能判斷相對血流速度，無法得出絕對流速值，也不能判斷血流方向，要解決這一問題可將成像系統(tǒng)與多普勒測速或雙光子活體成像技術相整合[6]。④LSI可較直觀地觀察皮質血流變化和側枝情況，但受激光穿透力的影響，無法對深部腦組織血流進行活體觀測，可與磁共振功能成像等影像學技術形成互補[12]。但無論如何，LSI無疑是目前最為直觀和實時的高分辨率血流觀測手段。

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Laser Speckle Contrast Imaging of Collateral Blood Flow during Cerebral Infarction in Rats

Objective:To study the collateral blood flow and focal cerebral blood flow (CBF)in middle cerebral artery occlusion(MCAO)rats by laser speckle imaging(LSI).Methods:A permanent MCAO (pMCAO)model was generated in male SD rats(n=9)by the intraluminal filament technique.LSI was used to measure CBF and collateral blood flow in the ischemic cortical area and MCA territory after 90 min.The brain was stained with TTC to determine the infarct size 24 h later.Results:CBF was decreased in both the hemispheric cortical area and MCA territory in the first 15 min and increased blood flow velocity was observed in some animals later. Conclusion:LSI has high spatial and temporal resolution,and offers visual imaging.

rats;middle cerebral artery occlusion;laser speckle imaging;collateral blood flow

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.006

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內科武漢 430030 2.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院急診科湖北十堰 442000

2014-01-24

張?zhí)K明suming_zhang1@ 163.com