韓慶東，劉勝文，孫煒，謝蕊繁，雷霆，陳勁草，張華楸

他莫昔芬對小膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪后遷移和增殖的影響

韓慶東，劉勝文，孫煒，謝蕊繁，雷霆，陳勁草，張華楸

目的：觀察他莫昔芬（TAM）對氧糖剝奪（OGD）模型中小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2增殖和遷移的影響。方法：將BV-2細(xì)胞分為對照組（常規(guī)正常氧濃度+高葡萄糖+無胎牛血清培養(yǎng)基）、OGD組（1%氧濃度+無糖+無血清培養(yǎng)基）、OGD+TAM組（1%氧濃度+無糖+無血清培養(yǎng)基+TAM），采用劃痕試驗(yàn)，通過免疫熒光技術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2在不同氧濃度下的增殖和遷移情況。同時(shí)觀察TAM對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：與對照組相比，BV-2在OGD后細(xì)胞遷移加快（＜0.05）；OGD+TAM組遷移較OGD組下降（＜0.05）；OGD組Ki67陽性率的BV-2明顯高于對照組（＜0.05）；OGD+TAM組Ki67陽性率則明顯低于OGD組（＜0.05）。結(jié)論：缺氧可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，雌激素受體拮抗劑TAM能有效抑制這種活化。

他莫昔芬；小膠質(zhì)細(xì)胞；遷移；增殖；腦缺血

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的常駐免疫細(xì)胞，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程。特別是在缺血性腦血管病中，大量研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的活化（如炎癥因子分泌、遷移及增殖等）對神經(jīng)元的損傷和修復(fù)起不可忽視的作用[1-3]。如何調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而降低缺氧后神經(jīng)元損傷，促進(jìn)修復(fù)，一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。容積調(diào)控陰離子通道（volume regulated anion channels，VRACs）是一種廣泛存在于許多細(xì)胞表面的陰離子通道，在多種病理生理情況下參與細(xì)胞體積的調(diào)節(jié)[4]。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）是目前常用的一種VRACs阻斷劑。本實(shí)驗(yàn)通過觀測TAM在小膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）后遷移和增殖中的作用，探索TAM在腦缺血性疾病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 BV-2細(xì)胞系，由我院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 TAM（購于美國Sigma公司），大鼠抗小鼠OX-42單克隆抗體及兔抗小鼠Ki67單克隆抗體（購于美國Abcam公司），二抗Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、4%多聚甲醛、L-多聚賴氨酸、Triton及牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）及DAPI（購于武漢碧云天生物公司），高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（購于美國Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶（購于武漢基諾生物公司），6孔塑料培養(yǎng)板及24孔培養(yǎng)板（購于美國Corning公司），N2恒溫培養(yǎng)箱及CO2恒溫培養(yǎng)箱（購于美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡及正置熒光顯微鏡（購于日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 BV-2細(xì)胞系培養(yǎng) 將凍存于－80℃的BV-2細(xì)胞系復(fù)蘇后，分別均勻種植于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔塑料培養(yǎng)板里（5×105/孔）用于劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；將用0.01%多聚賴氨酸包被過的的無菌小圓玻片置于24孔塑料培養(yǎng)板中，將上述BV-2細(xì)胞種植于該24孔板中圓玻片上（1×104/孔）。給予TAM干預(yù)前，將上述種植于6孔板及24孔板中的BV-2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培育，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱24 h，貼壁達(dá)80%時(shí)進(jìn)行劃痕試驗(yàn)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將BV-2細(xì)胞分為3組：對照組（常規(guī)正常氧濃度+高葡萄糖+無胎牛血清培養(yǎng)基）、OGD組（1%氧濃度+無糖+無血清培養(yǎng)基）、OGD+TAM組（1%氧濃度+無糖+無血清培養(yǎng)基+TAM）。OGD組和OGD+TAM組進(jìn)行10 min OGD后，均將無糖無血清DMEM培養(yǎng)基更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，OGD+TAM組在OGD時(shí)及隨后的高糖DMEM培養(yǎng)基再灌注時(shí)均給予TAM（10 μg/mL）干預(yù)。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 依照文獻(xiàn)[2,5]，將上述種植于6孔板的BV-2細(xì)胞用無菌微量加樣器尖頭于貼壁于孔底的細(xì)胞縱行劃痕，并且依據(jù)坐標(biāo)位置劃痕位置一致，用PBS各孔輕輕沖洗震蕩。3組在OGD及 OGD+TAM組行OGD后10 min后的0、24及48 h（n=5）均倒置相差顯微鏡拍照，記錄劃痕后兩平行線間圍繞的空白面積。

1.2.3 增殖實(shí)驗(yàn) 將上述種植于24孔板的BV-2細(xì)胞同樣分為3組，按前述OGD及再灌注方法將BV-2細(xì)胞OGD后再灌注3 h，給予免疫熒光染色，分別以大鼠抗小鼠OX-42單克隆抗體及兔抗小鼠Ki67單克隆抗體雙染上述3組細(xì)胞（OX-42為BV-2細(xì)胞系特異性標(biāo)志物，核蛋白ki-67標(biāo)記BV-2增殖），對應(yīng)二抗Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG及FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，染色完成后于正置熒光顯微鏡避光拍攝（n=5）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用NIH Image J軟件分析劃痕結(jié)果，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以（±s）表示，檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)

劃痕后0、24、48 h，BV-2細(xì)胞在缺氧后被激活，表現(xiàn)為特征性形態(tài)學(xué)改變，即細(xì)胞體較之前飽滿，分支較靜息狀態(tài)下更粗短，倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)BV-2向中間劃痕所造成的空白區(qū)出現(xiàn)不同程度遷移。48 h后，與對照組比較，OGD組的空白面積明顯縮?。ǎ?.05）；OGD+TAM組劃痕形成空白區(qū)域面積則較OGD組縮?。ǎ?.05），見圖1。

圖1 劃痕后0、48 h 3組BV-2細(xì)胞的遷移（標(biāo)尺為200 μm）

2.2 增殖實(shí)驗(yàn)

缺氧誘導(dǎo)BV-2增殖，OGD組Ki67陽性率的 BV-2明顯高于對照組（＜0.05）；OGD+TAM組Ki67陽性率則明顯低于OGD組（＜0.05），見圖2，說明TAM可明顯抑制BV-2增殖。

圖2 3組BV-2細(xì)胞系Ki67表達(dá)熒光圖（A）及直方圖（B）（標(biāo)尺為100 μm）

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞占整個(gè)腦組織細(xì)胞數(shù)量的10%左右，分為分支狀的靜息型小膠質(zhì)細(xì)胞及阿米巴型改變的活化細(xì)胞[6,7]。在缺血損傷過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的時(shí)間階段，通過介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)在神經(jīng)的損傷和修復(fù)中起重要作用[8,9]。小膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧后，可發(fā)生遷移和增殖，且產(chǎn)生促炎因子。這在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的缺氧后炎癥損傷起明顯作用。TAM作為雌激素受體調(diào)控劑，廣泛用于乳腺腫瘤的治療，有研究顯示它對腦缺血、外傷及脊髓損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[2,10]。近年來發(fā)現(xiàn)其能有效抑制膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表面VRACs的活化，進(jìn)而調(diào)控興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（如谷氨酸）的釋放，降低缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元興奮性損傷。筆者前期的研究表明在大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型中，TAM能有效改善腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。其機(jī)制可能是通過調(diào)控VRACs的活性而發(fā)揮作用的。但是其對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，及其參與的炎癥反應(yīng)的作用目前尚不明確。本研究基于上述情況，對TAM在缺氧后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用展開初步探索。

研究表明，腦缺血、腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞會因刺激而產(chǎn)生活化，向炎癥區(qū)域及臨近區(qū)域可發(fā)生多種趨化因子導(dǎo)致的遷移，進(jìn)而在小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生多種炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[11,12]。TAM對小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能存在抑制，表現(xiàn)為炎癥因子TNF-α、IL-1β等分泌減少。Wang等[1]利用維生素E的類似物—生育酚干預(yù)一過性前腦缺血發(fā)現(xiàn)，缺血后誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞向CA1區(qū)遷移聚集，進(jìn)而導(dǎo)致可能的自由基產(chǎn)生而造成神經(jīng)元的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD情況下，與對照組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞在施加TAM干預(yù)后遷移均出現(xiàn)減弱，說明在OGD情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移明顯加強(qiáng)，但TAM可抑制這一過程，進(jìn)而發(fā)揮可能的神經(jīng)保護(hù)作用。對于TAM抑制小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的原因，可能因TAM抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而使得缺氧刺激導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移減弱有關(guān)；而有學(xué)者認(rèn)為抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)區(qū)域的遷移/趨化，可被視作增加抗炎癥反應(yīng)的作用[13]。

生理狀態(tài)下，當(dāng)BV-2細(xì)胞系給予不同濃度的TAM后，細(xì)胞周期在G0/G1期明顯阻滯，而在G2/M期及S期則縮短，呈現(xiàn)出CyclinD1細(xì)胞周期蛋白被明顯下調(diào)，且這一效應(yīng)表現(xiàn)為時(shí)間及濃度的依賴性[14]。對于體外培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞系在OGD的缺血再灌注模型中，本研究進(jìn)行進(jìn)一步探討。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓半切損傷后，給予細(xì)胞周期阻斷劑Olomoucine可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，使相關(guān)的炎癥反應(yīng)及組織水腫減輕，起到神經(jīng)組織的保護(hù)作用[15]。在細(xì)胞周期阻滯劑應(yīng)用于小膠質(zhì)細(xì)胞OGD時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A、Cyclin B和Cyclin E不同程度被抑制，細(xì)胞周期的活化被阻滯劑以劑量依賴性的形式阻滯在周期的G1/S和G2/M期，且在動物實(shí)驗(yàn)的缺血再灌注模型中也可印證這一現(xiàn)象[16]。TAM抑制小膠質(zhì)細(xì)胞VRACs，影響OGD后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能通過對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，諸如CyclinD1等的調(diào)節(jié)，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖；有研究發(fā)現(xiàn)，TAM可通過影響MAPK信號通路，實(shí)現(xiàn)對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制[14]，這一過程包括小膠質(zhì)細(xì)胞遷徙及增殖的抑制。從TAM干預(yù)OGD后BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的ki67表達(dá)看，其表達(dá)較單純OGD明顯下降，細(xì)胞增殖被抑制。這也許表明TAM的干預(yù)后，OGD誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖被抑制，從而細(xì)胞周期受到相應(yīng)的影響，周期蛋白表達(dá)也許被抑制，進(jìn)而在缺氧條件下減弱由于小膠質(zhì)細(xì)胞被激活增殖而產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

總之，本研究以文獻(xiàn)中的OGD模型構(gòu)建，將TAM施加于BV-2細(xì)胞缺氧再灌注過程中，明確TAM可抑制BV-2細(xì)胞遷移及增殖，這可能為研究腦缺血性損傷提供可能的治療策略。

[1]Wang HK,Park UJ,Kim SY,et al.Free radical production in CA1 neurons induces MIP-1alpha expression,microglia recruitment,and delayed neuronal death after transient forebrain ischemia[J].J Neurosci,2008,28:1721-1727.

[2]Zhang H,Xie M,Schools GP,et al.Tamoxifen mediated estrogen receptor activation protects against early impairment of hippocampal neuron excitability in an oxygen/glucose deprivation brain slice ischemia model[J].Brain Res, 2009,1247:196-211.

[3]Park HY,Han MH,Park C,et al.Anti-inflammatory effects of fucoidan through inhibition of NF-kappaB,MAPK and Akt activation in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells [J].Food Chem Toxicol,2011,49:1745-1752.

[4]Zhang H,Cao HJ,Kimelberg HK,et al.Volume regulated anion channel currents of rat hippocampal neurons and their contribution to oxygen-and-glucose deprivation induced neuronal death[J].PLoS One,2011,6:e16803.

[5]Loo AE,Ho R,Halliwell B.Mechanism of hydrogen peroxide-induced keratinocyte migration in a scratch-wound model[J].Free Radic Biol Med,2011,51:884-892.

[6]Benarroch EE.Microglia:Multiple roles in surveillance,circuit shaping,and response to injury[J].Neurology,2013,81:1079-1088.

[7]Vázquez Villoldo N,Domercq M,Martin A,等.P2X4受體對活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2014,01:50-51.

[8]Neumann J,Gunzer M,Gutzeit HO,et al. Microglia provide neuroprotection after ischemia [J].FASEB J,2006,20:714-716.

[9]Hu X,Li P,Guo Y,et al.Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia[J].Stroke,2012,43:3063-3070.

[10]Franco RN,Due?as Jiménez JM,De la Torre Valdovinos B,et al.Tamoxifen favoured the rat sensorial cortex regeneration after a penetrating brain injury[J].Brain Res Bull,2013,98:64-75.

[11]渠文生,方軍,楊琴,等.西妥昔對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移的影響[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2011,6:84-89.

[12]Han Q,Liu S,Li Z,et al.DCPIB,a potent volume-regulated anion channel antagonist,Attenuates microglia-mediated inflammatory response and neuronal injury following focal cerebral ischemia [J].Brain Res,2014,1542: 176-185.

[13]Chao CC,Hu S,Shark KB,et al.Activation of mu opioid receptors inhibits microglial cell chemotaxis[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,281: 998-1004.

[14]李正偉.VRACs阻斷劑對小膠質(zhì)細(xì)胞生長和活化的調(diào)控及機(jī)制研究[D].武漢:華中科技大學(xué),2012.

[15]Tian DS,Xie MJ,Yu ZY,et al.Cell cycle inhibition attenuates microglia induced inflammatory response and alleviates neuronal cell death after spinal cord injury in rats[J].Brain Res,2007,1135:177-185.

[16]Zhang Q,Chen C,LüJ,et al.Cell cycle inhibition attenuates microglial proliferation and production of IL-1beta,MIP-1alpha,and NO after focal cerebral ischemia in the rat[J].Glia, 2009,57:908-920.

Tamoxifen Inhibits the Migration and Activation of Microglia after Oxygen-glucose Deprivation

Objective:To observe the effects of tamoxifen (TAM)on the migration and proliferation of BV-2 cells in oxygen-glucose deprivation(OGD)models.Methods:BV-2 cells were divided into control group(normal oxygen concentration+high glucose+fetal bovine serum free medium),OGD group (1%oxygen+sugar free+ serum-free medium),OGD+TAM group(1%oxygen+sugar free+serum-free medium+TAM).After performing scratch test,migration and proliferation of BV-2 cells were examined by photographs and immunohistochemistry. Results:BV-2 cells in the OGD group shown faster migration than those in the control group (＜0.05).The administration of TAM suppressed the migration of BV-2 cells compared to the OGD group (＜0.05).The percentage of Ki67 positive cells in the OGD group was higher than that in the control group,and the application of Tam reduced the percentage of Ki67 positive cells compared with that in the OGD group(＜0.05).Conclusion: Tamoxifen may play a neuro-protective role in hypoxic condition by suppressing the migration and proliferation of BV-2 cells after OGD.

tamoxifen;microglia;migration;proliferation;cerebral ischemia

R741；R364.4

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.003

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科武漢 430030

國家臨床重點(diǎn)專科；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.81371381）

2014-03-13

張華楸zhanghq_04@yahoo. com