李建鳳，廖立敏，2*

1內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院;2 四川省高等學(xué)?！肮悘U棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)江 641112

柑橘類水果為我國(guó)第三大國(guó)際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品，四川是我國(guó)柑橘類水果的主要產(chǎn)地之一，盛產(chǎn)檸檬、柑橘、塔羅科血橙和臍橙等柑橘類水果。內(nèi)江地區(qū)是四川柑橘類水果的主要生產(chǎn)基地之一，四川安岳，早在二三十年代就開始種植檸檬，被譽(yù)為“中國(guó)檸檬之鄉(xiāng)”。內(nèi)江現(xiàn)有檸檬種植面積13 萬(wàn)畝，其附近的安岳現(xiàn)有檸檬種植面積23 萬(wàn)畝，總產(chǎn)值近18 億元。內(nèi)江現(xiàn)有飲料制造企業(yè)近50 家，內(nèi)江及安岳年加工柑橘類鮮果100 余萬(wàn)噸。而柑橘類果皮渣是柑橘類水果加工業(yè)的主要副產(chǎn)物，約占整個(gè)果重的25%～40%，因此內(nèi)江及安岳每年產(chǎn)生約25～40 余萬(wàn)噸的柑橘類果皮渣廢棄物。傳統(tǒng)的處理方法是將其直接進(jìn)行丟棄、填埋或小部分加工成飼料，從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的角度分析，都是不科學(xué)、不合理的解決途徑，造成了極大的浪費(fèi)，給當(dāng)?shù)丨h(huán)境帶來(lái)了負(fù)面影響。因此柑橘果皮的綜合利用對(duì)提高柑橘加工廠的經(jīng)濟(jì)效益和減少污染、保護(hù)環(huán)境都是十分有利的。

檸檬皮渣中含有豐富的果膠［1］、黃酮［2］、檸檬苦素等活性物質(zhì)，對(duì)其合理利用具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。檸檬苦素類化合物是一類三萜類物質(zhì)，研究表明其具有明顯的抗菌［3］、抗癌［4］和昆蟲不育［5］等作用。目前對(duì)苦素類物質(zhì)的提取分離方法主要有水抽提法［6］、有機(jī)溶劑提取法［7］、超臨界CO2萃取法［8］、超聲提取法［9］和離子交換法［10］等。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取溶劑，采用超聲波提取檸檬皮渣中的苦素類物質(zhì)，并運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝條件，以期提高檸檬皮渣中苦素的得率，為開發(fā)柑橘類果皮渣中的苦素類物質(zhì)提供有益參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

UVmini-1240 紫外可外分光光度計(jì)(日本島津公司);KQ-400KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CP2202S 電子分析天枰(賽特利斯(北京)有限公司)。

檸檬苦素標(biāo)樣(西安開來(lái)生物工程有限公司，檸檬苦素，含量大于等于98%);無(wú)水乙醇、甲醇、二氯甲烷、濃硫酸、香草醛等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?檸檬采自四川安岳。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬皮渣苦素的提取

稱取檸檬粉末5 g，置錐形瓶中加入一定量和一定濃度的乙醇(用保鮮膜包住瓶口)，50 ℃下超聲波(400 W)處理一定時(shí)間。處理后抽濾，用少量乙醇清洗燒杯，清洗液一并過濾，濾液濃縮至干，用約40 mL 二氯甲烷溶解燒瓶中的殘余物，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中二氯甲烷定容至刻度，得待測(cè)提取液。

1.2.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確到0.00001 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容得標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL。取1.4 mL 0.10 mg/mL 的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入0.4 mL 0.02 g/mL 香草醛乙醇溶液振蕩混勻，靜置2 min，加入濃硫酸0.6 mL，迅速振蕩10 s，加入2.5 mL 甲醇溶液混勻顯色，二氯甲烷定容至5 mL，靜置10 min，在300～700 nm 處進(jìn)行光譜掃描，觀察最大吸收峰波長(zhǎng)為547 nm。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的吸光度，用最小二乘法作線性回歸，得檸檬苦素濃度C與吸光度值A(chǔ) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:C=0.223A-0.036，R=0.9981。

1.2.3 檸檬苦素提取得率計(jì)算

取1.4mL 檸檬苦素提取液于試管中，按上述方法顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算檸檬苦素提取率。檸檬苦素提取率=C×V/m=C×50/5(mg/g)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在查閱參考文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文主要考察乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比對(duì)提取效果的影響，應(yīng)用Design Expert 7.0.0 軟件，采用Box-Behnken Design 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，以液固比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)為影響因素，苦素提取率(Y)為響應(yīng)值設(shè)立處理組，因子編碼及水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

共設(shè)計(jì)17個(gè)處理組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

用Design Expert 7.0.0 軟件將表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到檸檬苦素提取率對(duì)液固比(A)、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)式回歸模型。對(duì)所建立的響應(yīng)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3 可知，試驗(yàn)選用的模型高度顯著(P＜0.01)，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以用此模型來(lái)分析以乙醇為溶劑采用超聲波對(duì)檸檬皮渣苦素的提取。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，模型一次項(xiàng)A、C 較顯著(P＜0.1)，二次項(xiàng)B2和C2顯著(P＜0.01)，其他不顯著(P ＞0.1)。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of significance for regression coefficient

2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，圖1、圖2 和圖3 為液料比(A)、乙醇濃度(B)、處理時(shí)間(C)在其中一個(gè)固定時(shí)，另外兩個(gè)對(duì)檸檬皮渣檸檬苦素提取影響曲面圖。比較圖1、圖2 和圖3 的曲面圖可知，液固比(A)、超聲波處理時(shí)間(C)對(duì)檸檬皮渣檸檬苦素提取的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡峭，乙醇濃度(B)不顯著，表現(xiàn)為曲線相對(duì)平滑。可能是檸檬苦素類化合物在400W 超聲波處理下，在乙醇溶液中浸出速度都很大，故提取乙醇濃度的變化對(duì)檸檬苦素提取率影響不顯著。比較圖1、圖2 和圖3 的等高線圖可以看出液料比(A)、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)的交互影響顯著性相似，表現(xiàn)為等高線相對(duì)密度相似，這與方差分析結(jié)果一致。

圖1 乙醇濃度、液固比及其交互作用對(duì)提取率的影響Fig.1 Effects of liquid solid ratio，ethanol concentration and their interactions on the extraction yield

圖2 液固比、提取時(shí)間及其交互作用對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of liquid solid ratio，extraction time and their interactions on the extraction yield

圖3 乙醇濃度、提取時(shí)間及其交互作用對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration，extraction time and their interactions on the extraction yield

圖4 預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)圖Fig.4 Correlation plot of predicted extraction yield and actual extraction yield

2.3 模型優(yōu)化與驗(yàn)證

模型對(duì)各實(shí)驗(yàn)號(hào)的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)圖見圖4，圖4 可以發(fā)現(xiàn)大部分樣本點(diǎn)落在45 度的對(duì)角線附近，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間誤差較小，模型能用于檸檬苦素提取率的預(yù)測(cè)。在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design Expert 軟件分析得出，檸檬苦素最佳提取條件為:液固比為16.80∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為74.55%，超聲波處理時(shí)間為36.94 min，提取率理論預(yù)測(cè)值為1.752 mg/g。而最優(yōu)工藝條件恰好與表2 中處理號(hào)為5、10、11、16 和17的實(shí)驗(yàn)條件相近(液固比為15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲波處理時(shí)間為35 min)，這5個(gè)實(shí)驗(yàn)的提取率分別為1.698、1.725、1.734、1.727 和1.723 mg/g，平均值為1.721 mg/g，平均值與理論預(yù)測(cè)值為1.752 mg/g 接近，說(shuō)明響應(yīng)曲面得出的結(jié)論是正確的，即該方程與實(shí)際情況擬合很好，響應(yīng)曲面法適用于檸檬皮渣苦素超聲波提取工藝分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

本文利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert，采用Box-Behnken Design 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，分析得出檸檬皮渣檸檬苦素超聲波乙醇提取的最佳工藝條件，在最佳工藝條件下對(duì)檸檬皮渣苦素進(jìn)行提取，不但提取液檸檬苦素含量最高，而且實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性好，說(shuō)明響應(yīng)曲面法得出的結(jié)論是正確的，本文得出的檸檬苦素最佳提取工藝具有一定開發(fā)價(jià)值。

1 Li JF(李建鳳)，Ren L(任磊)，Wang Z(王真)，et al.Study on ultrasound-assisted extraction of pectin from lemon peel by using surface response method.Sci Technol Food Ind (食品工業(yè)科技)，2013，34:267-269.

2 Liao LM(廖立敏)，Liu Y(劉月)，Li JF(李建鳳)，et al.Study on microwave extraction of total flavonoids of lemon peel using response surface methodology.J Huazhong Norm Univ，Nat Sci(華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2012，46:569-572.

3 Kumar M，Upreti RK.In vitro effect of azadirachin on aerobic bacteria of rat intestine.Bull Environ Contam Toxicol，2003，70:1205-1212.

4 Poulose SM，Harris ED，Patil BS.Antiproliferative effects of citrus limonoids against human neuroblastoma and colonic adenocarcinoma cells.Nutr Cancer，2006，56:103-112.

5 Luo SZ(羅水中)，Pan LH(潘利華)，He JJ(何建軍)，et al.Extraction and antibiotics of limonin in citrus seeds.Acade Period Farm Prod Proc (農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊)，2006，10:105-107.

6 Sawabe A，Moritab M，Kiso T，et al.Isolation and characterization of new limonoid glycosides from Citrus unshiu peels.Carbohyd Res，1999，315:142-147.

7 Ishii T，Ohta H，Nogata Y.Limonoids in seeds of iyo tangor.Food Sci Technol Res，2003，9:62-164.

8 Zeng XY(曾祥燕)，Zhao LZ(趙良忠).Application of response surface methodology to optimize extraction process for nomilin from orange peel with supercritical carbon dioxide.Food Sci(食品科學(xué))，2011，32(22):65-69.

9 Li JL(黎繼烈)，Zhang H(張慧)，Zeng CZ(曾超珍)，et al.Study on ultrasonic extraction technology of limonin from the kumquat.J Chin Inst Food Sci Technol (中國(guó)食品學(xué)報(bào))，2009，9:96-101.

10 Wang H(王輝)，Xu HX(徐環(huán)昕)，Kou ZF(寇正福)，et al.Separation and purification of limonin by adsorption resin from pomelo seed.Ion Exchange Adsorp(離子交換與吸附)，2010，26:256-263.