（黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063）

檸檬（Citruslimon）為蕓香科柑橘屬植物，又稱檸果、益母果等，含大量檸檬酸、維生素C、糖類等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值極高[1]。檸檬皮富含多糖類化合物，具有降血脂、抗衰老、抗炎等功效，對(duì)脾胃氣滯、脘腹脹痛、食欲不振等也有較好的治療效果，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間[2]。目前，從植物中提取多糖的方法有溶劑浸提法、酶提取法、熱水提取法等[3-4]，但大都存在提取工藝復(fù)雜、效率低等缺點(diǎn)。近年，超聲波輔助提取技術(shù)已十分成熟，提取率高、提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便。本文以檸檬皮為原料，利用超聲波輔助方法提取檸檬皮多糖，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)影響多糖提取率較顯著的因素料液比、超聲時(shí)間、溫度、超聲功率進(jìn)行優(yōu)化，并探討其體外抗氧化活性，為深度開發(fā)利用檸檬皮資源提供一定的理論支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MF2104型電子天平（上海亞津電子科技有限公司）；YSF-25型粉碎機(jī)（山東精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司）；JP-301ST型超聲波清洗器（常州歐達(dá)超聲波設(shè)備有限公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；3號(hào)和5號(hào)藥典篩（新鄉(xiāng)市先恒機(jī)械設(shè)備有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（冠森生物有限公司）；SHBIIIG臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；VRT-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海德賢實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 材料

檸檬（產(chǎn)地：海南萬(wàn)寧），購(gòu)于鄭州家輝生鮮超市；葡萄糖（GR），三吡啶三吖嗪（TPTZ，AR，上海阿拉?。槐椒?，無(wú)水乙醇，濃H2SO4（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；FeSO4，冰醋酸（AR，天津市永晟精細(xì)化工）；5 %苯酚溶液（自制）。

2 方法

2.1 檸檬皮的預(yù)處理

將新鮮檸檬去皮，洗凈、除去雜質(zhì)，自然晾干，于烘箱中55 ℃干燥至恒重，粉碎得檸檬皮粉末，先后過(guò)3號(hào)和5號(hào)藥典篩，于室溫下密封保存，備用。

2.2 檸檬皮多糖提取條件的單因素試驗(yàn)

自然pH值下，精密稱取1.000 g預(yù)處理后檸檬皮粉末，分別設(shè)置料液比1:20，1:30，1:40，1:50，1:60（g/ml），超聲溫度30，40，50，60，70 ℃，超聲時(shí)間10，20，30，40，50 min，超聲功率200，250，300，350，400 W，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)各因素分析的結(jié)果，分別選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）為考察因素，通過(guò)四因素三水平[L9（34）]正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化檸檬皮多糖的超聲波提取工藝。因素水平設(shè)置見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4 多糖提取率的計(jì)算

精密稱取葡萄糖對(duì)照品1.000 g于100 ml量瓶中，加水定容。精密移取溶液1.0 ml，定容至100 ml，得0.1 mg/ml對(duì)照品溶液。分別精密移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml葡萄糖對(duì)照品溶液，加蒸餾水至2.0 ml，加l5 %苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，定容至50 ml。靜置15 min，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值，并以葡萄糖對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。取檸檬皮多糖提取液，冷卻，抽濾，濃縮濾液，濾液定容至100 ml。精密移取1.0 ml，加濃硫酸10.0 ml，5 %苯酚溶液2.0 ml，定容至50 ml，靜置15 min，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖粗提取率[6]。

2.5 抗氧化活性試驗(yàn)

采用鐵離子還原法（FRAP法）測(cè)定體外抗氧化活性。取1.8 ml FRAP工作液（pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、TPTZ溶液與FeCl3溶液按一定比例混合[7]），依次加入100，200，300，400，500，600，700，800 μmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 ml，37 ℃放置15 min，于593 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]。精密量取檸檬皮多糖粗提液，用水稀釋至不同濃度，加FRAP工作液6 ml和超純水600 μl，置于37 ℃水浴鍋中，15 min后測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處的吸光度。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖提取液抗氧化能力以FeSO4摩爾濃度表示。

2.6 數(shù)據(jù)處理和分析

單因素試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線均采用OriginPro8.5軟件作圖，測(cè)定結(jié)果為5次平行測(cè)定的平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響 按2.4項(xiàng)下方法，固定超聲時(shí)間20 min，溫度50 ℃，超聲功率300 W，按料液比1:20，1:30，1:40，1:50，1:60（g/ml）提取檸檬皮多糖，探索料液比對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響

由圖1可見，檸檬皮多糖提取率隨料液比的增加呈逐漸升高而后下降的趨勢(shì)，在料液比為1:40時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值。這可能是由于在一定程度上增加溶劑體積可增大與浸提物的接觸面積，對(duì)多糖提取有利，溶劑量繼續(xù)增加時(shí)檸檬皮多糖的提取率達(dá)到飽和，但溶劑量過(guò)多時(shí)，其他雜質(zhì)同時(shí)溶出[10-11]，導(dǎo)致提取率降低。因此，1:40為提取多糖的最佳料液比。

3.1.2 最佳超聲時(shí)間的確定 按2.4項(xiàng)下方法，固定料液比為1:40，超聲溫度50 ℃，超聲功率300 W，探索超聲時(shí)間對(duì)檸檬皮中多糖提取率的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響

由圖2可見，隨超聲時(shí)間的增加檸檬皮多糖的提取率逐漸升高，在時(shí)間為30 min時(shí)提取率達(dá)最大，提取率明顯下降。這是由于超聲時(shí)間短時(shí)，多糖溶出不完全，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雜質(zhì)的溶出量相應(yīng)增加，且多糖的結(jié)構(gòu)也可能遭到破壞[12]。因此，將最佳超聲時(shí)間確定為30 min。

3.1.3 最佳超聲溫度的確定 按2.4項(xiàng)下方法，固定料液比為1:40，超聲時(shí)間30 min，超聲功率300 W，探索超聲溫度對(duì)檸檬皮中多糖提取率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響

由圖3可見，多糖提取率隨超聲溫度的升高先增加后降低，說(shuō)明溫度較低時(shí)，多糖溶出量較少，在超聲溫度為50 ℃時(shí)提取率達(dá)最大值，之后多糖分子結(jié)構(gòu)可能由于溫度過(guò)高而發(fā)生改變，而且會(huì)消耗能量，導(dǎo)致對(duì)多糖的提取不利。因此，選擇提取溫度為50 ℃較為合理。

3.1.4 最佳超聲功率的確定 按2.4項(xiàng)下方法固定料液比為1:40，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃，探索超聲功率對(duì)檸檬皮中多糖提取率的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)檸檬皮多糖提取率的影響

由圖4可見，多糖提取率隨著超聲功率的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，超聲功率低于250 W時(shí)提取率明顯增加，250 W時(shí)提取率最高，達(dá)10.20 %，繼續(xù)增加超聲功率多糖提取率陡然降低，且增加原料的消耗。因此，選擇超聲功率為250 W。

3.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 檸檬皮多糖正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表2可見，超聲功率對(duì)提取率的影響最大，各因素對(duì)檸檬皮多糖提取率影響的主次順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即超聲功率＞超聲時(shí)間＞溫度＞料液比。由K值分析得出檸檬皮多糖的理論最優(yōu)提取條件為A2B3C2D3，即料液比1:40，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率300 W。

3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

將實(shí)際操作條件設(shè)置為料液比1:40，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率300 W，精密稱取3份檸檬皮粉末，在此工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，檸檬皮多糖的平均提取率為10.29 %，RSD=2.84 %，說(shuō)明超聲波提取檸檬皮多糖的方法可行，工藝穩(wěn)定、符合要求。

3.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)

分別以粗提液多糖質(zhì)量濃度、FeSO4摩爾濃度為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制曲線，即可得到檸檬皮多糖的體外總抗氧化能力[13-15]，見圖5。由圖5可見，檸檬皮多糖的抗氧化活性隨多糖濃度的增加呈線性增強(qiáng)，線性相關(guān)方程為y=0.1855x-0.0441，R2=0.9990。

圖5 抗氧化活性測(cè)試曲線

4 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取檸檬皮多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果顯示，檸檬皮多糖的最佳提取工藝為：料液比1:40，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率300 W。結(jié)果表明：在此工藝條件下檸檬皮多糖的提取率最高，多糖平均提取率為10.29 %，且超聲功率是超聲波提取過(guò)程中較為關(guān)鍵的因素。FRAP方法顯示檸檬皮多糖的抗氧化能力與濃度呈線性關(guān)系，并逐漸增強(qiáng)。

檸檬皮芳香怡人，含有豐富的氨基酸和維生素，在保健品和藥品市場(chǎng)前景廣闊。檸檬皮多糖的提取為檸檬皮多糖新的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)際參考，對(duì)推動(dòng)檸檬皮多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。