辛麗麗，姜 淼，許冬青，張 旭，陳 惠，龔婕寧

南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046

原發(fā)性支氣管肺癌為最常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%，其中約1/2 為肺腺癌。肺腺癌易侵襲、易轉(zhuǎn)移、易耐藥，嚴(yán)重威脅著患者的健康。中醫(yī)藥通過多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)治療方式在肺癌綜合治療模式中的作用引起越來越廣泛的關(guān)注，抗癌中藥復(fù)方的開發(fā)及中藥有效抗癌成分的提取已成為中醫(yī)藥治療肺癌的重要途徑。加味葦莖湯是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院多年臨床治療肺癌的驗(yàn)方，尤其在肺癌早期，以清熱活血為原則，合理應(yīng)用該方可以有效改善患者的臨床癥狀，提高生存質(zhì)量［1］。本研究選擇加味葦莖湯及相關(guān)成分芹菜素為研究藥物，觀察其對肺腺癌A549 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，從而探討該方藥治療肺癌的主要作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

健康新西蘭兔10 只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(蘇)2007-0008;肺癌細(xì)胞A549，購自中國科學(xué)院上海研究院。

1.2 藥物

加味葦莖湯:蘆根、冬瓜子、苡仁、桃仁、虎杖、半枝蓮，各藥量比例為:10∶8∶10∶3∶10∶10，藥材購自南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部，經(jīng)中藥專家鑒定屬正品。常規(guī)煎煮濃縮為100%中藥合劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ鄄怂?購自中檢所)。

1.3 試劑與儀器

1640 培養(yǎng)液(Gibco，1171219);胎牛血清(Gibco，10099-141);胰蛋白酶(solarbio，T8150);MTT(solarbio，705B059);二甲亞砜(DMSO)(aladdin，B1328005);多聚甲醛(永華，040829);hoechst33342染料(solarbio，B8040)。

光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，8A12661);自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(ETL，182473);流式細(xì)胞儀(ETL，E2901);熒光顯微鏡(OLYMPUS，3H06225)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備

健康新西蘭兔隨機(jī)分為含藥血清組和對照血清組。含藥血清組以人等效劑量的8 倍量中藥灌胃，給藥劑量為57.12 g/kg·d，每天分2 次給藥，連續(xù)給藥3 d，第3 d 灌胃1 次，給足1 天劑量。末次灌胃前禁食12 h，給藥后1 h 在家兔清醒狀態(tài)下(局麻)從頸動(dòng)脈采血，常規(guī)分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，用0.22 μm 醋酸纖維素膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩φ昭褰M以生理鹽水灌胃，同法采血制備血清。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肺腺癌細(xì)胞A549 用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整濃度為1 ×105個(gè)/mL，分別用各種濃度的含藥血清及芹菜素處理細(xì)胞，未加藥組(只加單培)為空白對照組。RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋含藥血清，含藥血清濃度梯度為10%、5%、2.5%、0%(空白血清組)，空白血清補(bǔ)齊，使終末血清濃度均為10%。芹菜素溶解于DMSO 5‰，初濃度為10 mmoL/L，用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋成50 μmoL/L，倍比稀釋法稀釋，并保證每組DMSO 濃度為5‰。

2.3 分組方法

加味葦莖湯含藥血清分組設(shè)置:10%含藥血清組、5%含藥血清組、2.5%含藥血清組、空白血清組、空白對照組(單培組)。

芹菜素實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置:50、25、12.5、6.25 μmoL/L 芹菜素樣品組、空白對照組(單培組)、DMSO5‰組。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

每孔100 μL 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板上，培養(yǎng)過夜，于倒置顯微鏡下觀察不同濃度含藥血清及芹菜素作用后24、48 h 時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4.2 細(xì)胞生長抑制率

每孔100 μL 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板上，細(xì)胞貼壁后分組給藥，每組8 個(gè)復(fù)孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。并于24、48 h 提前4 h 每孔加入MTT 20 μL(10 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至4 h 后棄培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO 溶解液，低速振蕩15 min，空白孔調(diào)零，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處檢測OD 值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白對照組OD 值) ×100%

2.4.3 細(xì)胞周期

每孔1500 μL 單細(xì)胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后分組給藥，每組3 個(gè)復(fù)孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。消化收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為5 ×105個(gè)，加入BindingBuffer 懸浮細(xì)胞500 μL后，加入PI 2 μL 混勻，避光、室溫反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測。

2.4.4 細(xì)胞凋亡

每孔1500 μL 單細(xì)胞懸液接種于鋪有處理過的蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后分組給藥，每組3 個(gè)復(fù)孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。PBS洗滌細(xì)胞，多聚甲醛4 ℃固定20 min，hoechst33342 37 ℃染色10 min，PBS 洗片后，熒光顯微鏡下觀察和拍攝細(xì)胞凋亡狀況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS15.0 計(jì)算，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及F 方差齊性檢驗(yàn)。方差齊用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有顯著性意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細(xì)胞形態(tài)的影響

結(jié)果顯示，空白對照組、空白血清組、DMSO 5‰組的細(xì)胞貼壁生長，幾乎無脫落，胞漿飽滿，舒展生長，貼壁牢固，相鄰細(xì)胞生長融合成片;含藥血清組及芹菜素組24、48 h 后出現(xiàn)不同程度細(xì)胞間連接不牢固，細(xì)胞逐漸脫落。脫落細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞形態(tài)變圓，胞膜完整，顆粒感、體積縮小，核固縮出現(xiàn)，核顏色加深，折光性增強(qiáng)。以50 μmoL/L 的芹菜素組作用48 h 最為明顯。

3.2 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細(xì)胞生長抑制率的影響

結(jié)果顯示，10%、5%、2.5%含藥血清作用于肺癌A549 細(xì)胞24 h 后，抑制率分別為31%、13%、10%;作用48 h 后，抑制率分別為45%、24%、8%，與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)?？瞻籽鍖υ摷?xì)胞生長無抑制作用。見表1。

芹菜素50、25、12.5、6.25 μmoL/L 作用于肺癌A549 細(xì)胞24 h 后，抑制率分別為34%、29%、28%、17%;作用48 h 后，抑制率分別為53%、44%、30%、9%，與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)。5‰ DMSO 對細(xì)胞有一定的毒害作用，但芹菜素組與DMSO 組比較，差異仍具有顯著性意義(P＜0.01)，見表2。

結(jié)果顯示:加味葦莖湯含藥血清及芹菜素對肺癌細(xì)胞A549 具有抑制作用，且呈一定的量效、時(shí)效關(guān)系。且作用相同時(shí)間后，芹菜素對細(xì)胞的抑制作用明顯高于含藥血清組。

表1 加味葦莖湯含藥血清對A549 細(xì)胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表1 加味葦莖湯含藥血清對A549 細(xì)胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表2 芹菜素對A549 細(xì)胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表2 芹菜素對A549 細(xì)胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.3 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細(xì)胞周期及凋亡率的影響

空白對照組DNA 組方圖為典型腫瘤細(xì)胞的G0/1 峰型。不同濃度含藥血清作用于肺癌A549 細(xì)胞后，G1 期細(xì)胞減少，G2 期細(xì)胞明顯增多，且時(shí)間越長、濃度越高，G2 期阻滯越明顯，并見細(xì)胞有凋亡。10%含藥血清作用細(xì)胞48 h 后，G2 期細(xì)胞比例由空白對照組的(6.50 ±0.30)增高至(34.80 ±0.74)%，是空白對照組的5.3 倍。空白血清組對細(xì)胞周期及凋亡無明顯影響，見表3(P＜0.01)。

不同濃度芹菜素作用于細(xì)胞后，G1 期細(xì)胞減少，G2 期細(xì)胞比例增加，但無劑量依賴性;48 h 細(xì)胞周期無明顯規(guī)律性改變，但凋亡率明顯增高，可見凋亡細(xì)胞形成的亞G1 峰，凋亡率隨著質(zhì)量濃度增加而逐漸升高，并呈一定的時(shí)效關(guān)系，50 μmoL/L 作用48 h 后，凋亡率達(dá)20.74%。溶劑組(5‰DMSO)對細(xì)胞周期及凋亡無明顯影響，見表4(P＜0.01)。

結(jié)果顯示:加味葦莖湯含藥血清主要通過將A549 細(xì)胞阻滯于G2 期、阻止細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂來發(fā)揮抗腫瘤作用;而芹菜素主要通過誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯強(qiáng)于含藥血清組。

表3 加味葦莖湯含藥血清對A549 細(xì)胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表3 加味葦莖湯含藥血清對A549 細(xì)胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表4 芹菜素對A549 細(xì)胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表4 芹菜素對A549 細(xì)胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.4 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下結(jié)果顯示，不同濃度含藥血清及芹菜素處理細(xì)胞，細(xì)胞核在24、48 h 時(shí)間段中均有破裂，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片或呈梅花狀，呈較典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。其中以芹菜素50 μmoL/L、含藥血清10% 48 h 的凋亡細(xì)胞最多，且細(xì)胞脫落，視野內(nèi)細(xì)胞核數(shù)明顯減少。單培組、空白血清組細(xì)胞核完整且均勻分布，細(xì)胞平展，邊緣平滑，未見有凋亡形態(tài)的細(xì)胞核。DMSO5‰組有偶見有少量凋亡細(xì)胞存在。

4 討論

臨床實(shí)踐證明，肺癌初期，正氣尚未受損，體內(nèi)一派邪熱熾盛之象，熱灼津液，煉液為痰;熱邪耗傷脈內(nèi)陰血，血行澀滯，加之邪熱傷絡(luò)動(dòng)血，導(dǎo)致瘀熱互結(jié)，從而出現(xiàn)咳嗽、咳痰、痰中帶血、發(fā)熱、胸脅刺痛、舌質(zhì)深絳等證候。此時(shí)中醫(yī)治療以攻為主，治以清熱解毒、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)［2］。清熱活血化痰法不僅可單獨(dú)用于肺癌實(shí)證初期，還可在顧護(hù)正氣的基礎(chǔ)上辨證使用，既能改善臨床癥狀，又具有放化療增效和減毒作用［3］。因此，清熱活血是臨床治療早期肺癌的主要方法，臨證常以此為原則組方用藥［4］。加味葦莖湯是以《備急千金要方》之葦莖湯加虎杖、半枝蓮而成，具有清肺化痰、逐瘀排膿的功效，芹菜素是其主要成分之一。

在肺癌發(fā)病機(jī)制中，痰瘀既是臟腑功能失調(diào)、邪毒蘊(yùn)肺的病理產(chǎn)物，又是致使正氣內(nèi)虛、邪毒與之膠結(jié)成塊的致病因素，葦莖湯清肺化痰、逐瘀排膿，具攻邪之力［5］?；⒄壤懲它S，清熱解毒，活血化瘀，祛痰止咳;半枝蓮清熱解毒，化瘀利尿，兩味藥均是諸多醫(yī)家臨床治療肺癌的常用藥。本研究在葦莖湯基礎(chǔ)上伍以虎杖、半枝蓮，助葦莖湯清肺熱、逐肺淤，加強(qiáng)其抗肺癌作用。且現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，該組方不僅可多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，而且富含芹菜素，加強(qiáng)了葦莖湯加味在本研究中的配伍意義。

芹菜素可通過抗氧化、調(diào)控腫瘤相關(guān)基因、影響腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］、抑制腫瘤血管形成及抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白酶的活性［7］，以及放化療增敏、化學(xué)預(yù)防等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，與其它黃酮類物質(zhì)(槲皮素、山奈黃酮)相比，芹菜素具有低毒、無誘變性等特點(diǎn)。

增殖能力增強(qiáng)、周期調(diào)節(jié)失控、凋亡異常是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先采用MTT 法計(jì)算生長抑制率檢測腫瘤細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度加味葦莖湯含藥血清及芹菜素處理后的增殖情況;為探究兩種藥物是否通過誘導(dǎo)凋亡抑制A549 細(xì)胞增殖，進(jìn)行了hoechst33342 熒光染色實(shí)驗(yàn);在此基礎(chǔ)上，為明確兩種藥物作用細(xì)胞后的凋亡率，及探究是否會(huì)通過周期阻滯抑制A549 細(xì)胞增殖，進(jìn)行了流式細(xì)胞儀PI 染色法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:加味葦莖湯含藥血清組及芹菜素組均能抑制A549 細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的量效、時(shí)效關(guān)系;兩組藥均能誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡，提示加味葦莖湯含藥血清、芹菜素抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖都能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這個(gè)途徑發(fā)揮作用;兩組藥對A549 細(xì)胞周期均產(chǎn)生了影響，與空白對照組比較，周期分布有了明顯變化(P＜0.05)。但兩組藥對A549 細(xì)胞作用后，各指標(biāo)數(shù)據(jù)差距明顯:作用相同時(shí)間后，芹菜素50 μmoL/L 組(最高濃度)對細(xì)胞的抑制作用明顯高于10%含藥血清組(最高濃度)(P＜0.01)，說明在本實(shí)驗(yàn)濃度梯度設(shè)置范圍內(nèi)，芹菜素對A549 細(xì)胞的增殖抑制作用優(yōu)于加味葦莖湯含藥血清;熒光顯微鏡下，芹菜素作用A549 細(xì)胞后，脫落細(xì)胞數(shù)、凋亡小體明顯多于含藥血清組，且根據(jù)流式檢測細(xì)胞凋亡率，芹菜素組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯優(yōu)于含藥血清組(P＜0.01)，進(jìn)一步證明了芹菜素使肺癌A549細(xì)胞凋亡明顯增加，與增殖抑制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相符，提示芹菜素主要是通過誘導(dǎo)凋亡方式抑制A549 細(xì)胞的生長;周期阻滯方面，加味葦莖湯含藥血清主要通過將A549 細(xì)胞阻滯于G2 期，阻止細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂來發(fā)揮抗腫瘤作用;芹菜素對細(xì)胞也有G2 期阻滯作用，但未呈現(xiàn)量效時(shí)效關(guān)系。

綜上所述，加味葦莖湯含藥血清及芹菜素引起的腫瘤生物學(xué)變化包括生長抑制、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，且不同生物學(xué)變化與藥物濃度與作用時(shí)間關(guān)系密切，加味葦莖湯含藥血清主要是通過將A549 細(xì)胞阻滯于G2 期抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而芹菜素主要指通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，其具體抗癌機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。中藥單體的研究在明確其生化作用的基礎(chǔ)上，豐富中藥復(fù)方的現(xiàn)代藥理研究，促進(jìn)具有“穩(wěn)中求勝”特性的中醫(yī)藥國際化。中藥復(fù)方作為中醫(yī)藥臨床最傳統(tǒng)最主流的方法，對其研究更有臨床指導(dǎo)意義。

1 Gu KB(顧恪波)，Wang X(王遜)，He LL(何立麗)，et al.Brief analysis on Prof.SUN Gui-zhi's common formulas for lung cancer.World J Int Tradit Western Med(世界中西醫(yī)結(jié)合雜志)，2013，02:187-189.

2 Huang ZQ(黃志慶)，Tian HQ(田華琴)，Huang XQ(黃小青).On the principles of traditional Chinese medicine for the treatment of lung cancer.J Chin Med(中醫(yī)學(xué)報(bào))，2012，06:663-664.

3 Li LN(李柳寧)，Liu WS(劉偉勝).Modified Qianjin Weijing decoction on lung cancer radio therapy of perioperative clinical application.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志)，2006，12:1599.

4 Tang YY(唐引引)，Xu LR(徐立然).Analysis on syndrome types and formula application in primary bronchogenic carcinoma of lungr in Chinese medicine.J Chin Med(中醫(yī)學(xué)報(bào))，2012，3:278-280.

5 Li C(李超)，Zhao JG(趙建國).Weijing decoction on the treatment of 1 case of lung cancer.Shanxi J Tradit Chin Med(山西中醫(yī))，2012，28(5):4.

6 Zheng ZW(鄭作文)，Lun YY(倫玉寧)，Zhao LL(趙麗麗).Effect of apigenin fromMallotus apeltaon proliferation and apoptosis in nude mice bearing human gastric carcinoma.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2012，13:214-216.

7 Lu HF，Chie YJ，Yang MS.Apigenin induces apoptosis in human lung cancer H460 cells through caspase-and mitochondriadependent pathways.Hum Exp Toxicol，2011，30:1053-1061.