王淑芬,董巍蕾,謝 晶,何 璐,周 曦,蔡艷林,劉 杰,謝宛玉(南華大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南 衡陽 421001)
microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的內(nèi)源性小RNA分子,通過與靶基因非編碼區(qū)特異性堿基配對從而調(diào)控靶基因的表達。miRNAs靶向調(diào)控大量的mRNAs,通過與基靶基因的3′非編碼區(qū)相互結(jié)合,從而誘導mRNA降解或者抑制蛋白的翻譯[1-2]。研究表明,miR-26a存在于兩個染色體位點,miR-26a-1位于3號染色體,miR-26a-2位于12號染色體。目前有關(guān)miR-26a在腫瘤中的作用的研究報道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào),其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)且能通過靶基因組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a在乳腺癌組織和細胞中顯著下調(diào),miR-26a模擬物能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長。通過凋亡試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),過表達miR-26a能誘導乳腺癌細胞凋亡[5]。miR-26a在肝癌、鼻咽癌、胃癌以及乳腺癌組織和細胞中表達下調(diào),且抑制腫瘤細胞的生長增殖[3-5]。MTDH,又名AEG-1,在多種腫瘤如食管鱗癌、胃癌、腎細胞癌、前列腺以及非小細胞肺癌中表達上調(diào)[6-10]。Li C等[11]研究顯示,MTDH在晚期黏液性卵巢癌中高表達,并且與患者的預后差和對順鉑耐藥相關(guān)。目前對于miR-26a與MTDH在卵巢癌中的研究尚未見報道。本研究擬采用qRT-PCR、Western blot以及MTT法檢測miR-26a在卵巢癌中的生物學作用及作用機制。
收集2008年1月~2013年7月期間,本院收治確診卵巢癌患者52例。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何化療藥物治療,中位年齡53(39~70)歲。病理診斷結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理科醫(yī)生確認,癌旁組織取自距癌組織5 cm以外。本次研究獲得南華大學附一醫(yī)院倫理組織批準以及研究對象的知情同意。
CAOV3為卵巢癌細胞株,由中山大學腫瘤防治中心惠贈。
miR-26a mimics及對照mimics購自Ambion公司。MTDH siRNA質(zhì)粒購自santa cruz公司。MTDH抗體和β-actin抗體購自santa cruz公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。PRIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。MTS細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。
取適量組織,用RNA提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增反應為20 μL體系,包括:Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL,2×SYBR Mix 10 μL,miRNA RT product 2.0 μL,MiR-PCR primers(5 μmol/L)0.4 μL,滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為:95 °C ×3 min,95 °C ×12 s,62 °C ×35 s,72 °C ×30 s,共35 個循環(huán)。以U6 snRNA為內(nèi)參,所測定的miR-26a的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。檢測MTDH mRNA 方法同上,其引物序列正向:5′-TGGCAAATGTGGCCAACA-3′,反向: 5′-TATTAGGTAACCGACCCCCTCTT-3′,以β-actin為內(nèi)參,所測定的MTDH mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。
將miR-26a mimics 或MTDH siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAOV3細胞,48 h后提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。各組取等量樣本,進行SDS-PAGE凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%BSA封閉,加入MTDH或GAPDH抗體,4 ℃過夜。TBST洗膜30 min,加入二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜30 min,加入ECL發(fā)光劑,X片曝光、顯影、定影。
取轉(zhuǎn)染后的CAOV3細胞,消化后接種細胞于96孔板中,每空5 000個細胞,每組設(shè)6個復孔,放37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基中作為調(diào)零孔。接種72 h后,每孔加20 μL MTS檢測試劑,37 ℃孵育2 h,用酶標儀測定492 nm波長吸光度值(OD492)。實驗重復3次。
qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-26a在52例卵巢癌癌旁組織、癌組織中的表達分別為1.05±0.18、0.69±0.16,兩者相比,差異有顯著性(P<0.01,圖1A);MTDH在52例卵巢癌癌旁組織、癌組織中的表達分別為1.11±0.21、3.49±0.54,兩者相比,差異具有顯著性(P<0.01,圖1B)。
圖1 miR-26a與MTDH在卵巢癌組織和癌旁組織中表達水平的分析
研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因[12],為了明確miR-26a對MTDH的蛋白質(zhì)表達的調(diào)控作用,將miR-26a mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌CAOV3細胞,以轉(zhuǎn)染miR-26a-control為陰性對照,轉(zhuǎn)染MTDH siRNA為陽性對照,轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-26a組和MTDH siRNA組MTDH蛋白表達水平較陰性對照組明顯降低(圖2)。即miR-26a能下調(diào)卵巢癌CAOV3細胞系中MTDH蛋白質(zhì)的表達。
圖2 Western blot檢測miR-26a對MTDH蛋白的影響
分別將miR-26a-mimics,miR-26a-control(陰性對照組)和MTDH siRNA以及siRNA-control(陰性對照組)轉(zhuǎn)入CAOV3細胞24、48、72 h后,通過MTT法檢測其對細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MTDH siRNA和miR-26a mimics組CAOV3細胞從48 h起增殖速度明顯減慢,與miR-26a control對照組細胞相比,差異均有顯著性(P<0.05,圖3),高表達miR-26a通過下調(diào)MTDH的表達,從而抑制卵巢癌CAOV3細胞的生長增殖。
圖3 miR-26a與MTDH siRNA抑制CAOV3細胞增殖
經(jīng)SPSS 16.0軟件相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在卵巢癌及其癌旁組織中miR-26a與MTDH的表達成負相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.043,P=0.032,差異具有顯著性(圖4)。
圖4 miR-26a與MTDH在卵巢癌及其癌旁組織中的相關(guān)性分析
卵巢癌在女性生殖腫瘤中的發(fā)病率居第六位,每年大約有230 000例新發(fā)病例[13]。卵巢癌的早期生存率很高,但是由于大多數(shù)患者就診時已是晚期,而且大部分病人對目前的化療案產(chǎn)生耐藥,所以化療藥物對卵巢癌患者的治療成功率很低[13]。每年約有140 000位患者死于卵巢癌,嚴重威脅著人民的生命健康[14]。這一狀況近十年來未能改善,卵巢癌生存率仍然很低,死亡率居各類婦科惡性腫瘤的首位,對婦女生命造成嚴重威脅,迫切需要新的治療藥物提高卵巢癌的生存率。
miRNA是長20-23nt的非編碼RNA,通過與靶基因3′-非翻譯區(qū)完全或不完全互補結(jié)合,抑制基因的翻譯或降解mRNA發(fā)揮調(diào)控基因表達的功能。目前,有上千的miRNA被發(fā)現(xiàn),已證實許多miRNA參與了發(fā)育、分化、凋亡、增殖及細胞死亡等生物過程并發(fā)揮重要作用[1,15]。多個miRNA在腫瘤中表達失調(diào)。其可能的機制有:miRNA所在基因發(fā)生缺失、擴增、轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控[2]。研究表明,miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因/抑癌基因的作用,調(diào)控腫瘤增殖、浸潤、凋亡及耐藥性等功能[16]。研究表明miR-26a在肝癌中下調(diào),其表達水平與肝癌患者生存時間及對干擾素治療的敏感性相關(guān)[3]。miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)且能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性[4]。同時miR-26a能明顯抑制乳腺癌細胞增殖生長、誘導乳腺癌細胞凋亡[17]。然而目前關(guān)于miR-26a在卵巢中的研究報道尚少見,本研究通過對卵巢癌和癌旁組織中miR-26a的表達檢測,發(fā)現(xiàn)miR-26a在卵巢組織中表達明顯下調(diào)。研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因,且本研究通過蛋白質(zhì)印跡試驗也進一步證實MTDH是miR-26a調(diào)控的靶基因。MTDH最初在胎兒膠質(zhì)細胞瘤中發(fā)現(xiàn),是一個HIV誘導的基因,并且作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實MTDH在多種惡性腫瘤中表達上調(diào),并且通過PI3K-AKT,NF-κB,MAPK以及Wnt/β-catenin信號途徑參與腫瘤發(fā)生的多種生物學過程[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)在CAOV3細胞中過表達miR-26a或干擾MTDH后能明顯抑制CAOV3細胞的增殖活力,表明miR-26a可能通過下調(diào)MTDH的表達,從而抑制卵巢癌CAOV3細胞的增殖。綜上所述,miR-26a在卵巢癌細胞中表達下調(diào),并通過直接靶向調(diào)控MTDH的表達發(fā)揮生物學作用,本文繼續(xù)深入miR-26a在卵巢癌中的功能和分子研究,系統(tǒng)闡明miR-26a參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制,為卵巢癌的治療提供了新的治療靶點。
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