趙紅衛(wèi)

（燕山大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院生物技術(shù)與工程系，河北 秦皇島066004）

精子有氧呼吸系統(tǒng)與精漿中抗氧化系統(tǒng)形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的氧化與抗氧化系統(tǒng)［1-2］，冷凍保存處理?yè)p耗抗氧化物質(zhì)，但凍后活精子繼續(xù)產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），凍后精液中抗氧化與氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致稀釋液中ROS濃度升高［3-4］。多余ROS存在于精子質(zhì)膜周圍而不能及時(shí)消除，以至于使精子質(zhì)膜脂質(zhì)不飽和脂肪酸氧化［5］，造成精子質(zhì)膜氧化呼吸功能低下、胞內(nèi)酶泄漏、DNA 破壞［6］和精卵融合能力降低［7］。因此，尋求能夠抑制或者抵抗ROS損傷的高效抗氧化物質(zhì)將成為解決問(wèn)題關(guān)鍵。紅景天多糖作為一種植物提取的抗氧化劑能夠很強(qiáng)地清除超氧陰離子自由基（＊O2-），并能夠有效抑制膜脂氧化［8］。Zhao等［9］研究表明，紅景天粗多糖能夠顯著抵抗凍后豬精液中的ROS，提高精子凍后質(zhì)量，但是紅景天粗多糖成分復(fù)雜、雜質(zhì)較多且粘滯性較高，影響精子正常觀察和進(jìn)一步生產(chǎn)應(yīng)用。因此，將紅景天粗多糖進(jìn)一步分離純化成為紅景天粗多糖在豬精液冷凍保存中的重要環(huán)節(jié)。本研究將對(duì)多紅景天粗多糖分離純化為紅景天粗多糖中基分（Middle Components of Rhodiola Polysaccharide，MCRP），并將 MCRP添加到豬精子冷凍稀釋液中，探索MCRP對(duì)豬精子冷凍解凍后精子活力以及相關(guān)指標(biāo)的影響，而且目前尚無(wú)MCRP應(yīng)用于精液冷凍的報(bào)道。MCRP在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用將為豬精子冷凍保存開辟新途徑，為豬冷凍精液生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑和MCRP的提取

化學(xué)藥品均采購(gòu)自于Sigma上海分公司（上海，中國(guó)）。MCRP提取自西藏紅景天（西藏大學(xué)提供）。MCRP提取過(guò)程，將風(fēng)干500 g紅景天根莖進(jìn)行粉碎，在80℃蒸餾水中浸泡5 h，利用紗布過(guò)濾粗粒固體物質(zhì)，再用濾紙除去微粒固態(tài)物質(zhì)，將濾液收集于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液中添加無(wú)水乙醇5℃過(guò)夜，出現(xiàn)5層沉淀，取中間層冷凍干燥獲得MCRP，干燥常溫保存，備用。

1.2 精液采集

豬精液采集于5頭杜洛克豬（2～4歲，2次／周），在整個(gè)試驗(yàn)中，公豬飼養(yǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)水平均保持穩(wěn)定，采用手握法采集精子，富集段精液用稀釋液濕潤(rùn)紗布過(guò)濾，將精子活率高于80%的精液用于試驗(yàn)。

1.3 冷凍精液處理

取約30 m L精液至預(yù)熱離心管中，23～25℃，800 g／min，離心8 min，棄上清，用同溫BTS（Beltsville thawing solution，表1）稀釋液重懸，降至室溫后轉(zhuǎn)移至15℃恒溫冰箱靜置2 h，然后15℃、600 g、離心8 min，棄上清，沉淀精子用冷凍稀釋液I（表1）重懸，精子密度1.5×109個(gè)／m L，重懸液轉(zhuǎn)移至5℃恒溫冰箱降溫2 h，再用冷凍稀釋液II稀釋（重懸精液：稀釋液II＝2：1），精子最終密度為1×109個(gè)／m L。此外，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)將MCRP按照一定的濃度添加到稀釋液I或稀釋液II中（見(jiàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)）。稀釋后的精液注入到冷凍麥管（IMVL Aigle公司，法國(guó)）并封口，繼續(xù)保留于5℃恒溫冰箱1.5 h，轉(zhuǎn)移到程序冷凍儀（Biotronics公司，英國(guó)），以1℃／min的速率從5℃降到-6℃，在-6℃穩(wěn)定平衡2 min，轉(zhuǎn)移至液氮液面約3 cm處進(jìn)一步降溫，降至-140℃時(shí)投入液氮，凍存。

表1 BTS稀釋液、冷凍稀釋液I和冷凍稀釋液II成分Table 1 Composition of BTS and semen extenders I and II

1.4 精子解凍評(píng)估

將麥管轉(zhuǎn)移至38℃水浴中50 s，與5 m L室溫（23～25℃）BTS稀釋液緩慢混合，并分成若干份，分別用于評(píng)估精子運(yùn)動(dòng)性能、線粒體活性、谷胱甘肽濃度、頂體完整率、質(zhì)膜完整性及質(zhì)膜氧化程度等。

1.4.1 精子運(yùn)動(dòng)性能的評(píng)估 精子運(yùn)動(dòng)指標(biāo)應(yīng)用精子計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)（Zoneking軟件有限公司，北京）進(jìn)行評(píng)估。分析系統(tǒng)設(shè)置：32幀／s，記錄頻次50 Hz，平均速率為25μm／s，速率小于10μm／s的精子為死精子，最大運(yùn)動(dòng)半徑為25μm，精子運(yùn)動(dòng)軌跡偏離直線小于10%視為精子直線運(yùn)動(dòng)。將解凍精液轉(zhuǎn)移在38℃水浴中20 min，密度調(diào)整為5×107個(gè)／m L，取5μL轉(zhuǎn)移至 Makler計(jì)數(shù)室（10 μm深），顯微鏡下分析觀測(cè)，每個(gè)樣本測(cè)定8個(gè)連續(xù)的視野，并攝像分析。測(cè)定指標(biāo)為精子活率、死亡率、直線運(yùn)動(dòng)率和超活力精子百分率。

1.4.2 線粒體活性的測(cè)定 利用羅丹明-123和碘化丙啶聯(lián)合染色的方法對(duì)精子線粒體功能進(jìn)行評(píng)定［10］。先將羅丹明-123配置成1 mg／m L的儲(chǔ)存液，分裝成20μL小份備用。取3μL羅丹明-123溶液加入1 m L精液樣本（精子密度為20×106個(gè)／m L）中，在避光37℃孵育20 min，再加入10μL碘化丙啶（0.5 mg／m L），37℃孵育10 min，離心（600×g，6 min）棄上清，用1 m L的PBS重懸精子。取10μL重懸液滴加到預(yù)熱載玻片上，蓋蓋玻片，用熒光顯微鏡（尼康120，日本）分別在490／515 nm（羅丹明-123）和545／590 nm（碘化丙啶）觀察大約200枚精子，并統(tǒng)計(jì)尾中段只顯示綠色熒光的精子。

1.4.3 熒光測(cè)定的頂體完整性 花生凝集素-異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate Peanut Agglutinin，F(xiàn)ITC-PNA）染色檢查精子頂體完整率［11］，取10μL精液均勻涂到載玻片上，室溫風(fēng)干，浸入到100 mg／m L FITC-PNA PBS溶液中，5℃閉光染色30 min，冰浴PBS中除浮染，閉光30 min，滴加固封劑（甘油90%和PBS 10%，V／V；磷-苯二胺0.1%，W／V），蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡觀察200個(gè)精子，精子頂體被均勻著色的為頂體完整精子，頂體區(qū)域未被著色或著色不均勻的為非完整精子頂體。

1.4.4 低滲腫脹試驗(yàn) 低滲腫脹試驗(yàn)（hypoosmotic swelling test，HOST）是將3 m L精液添加30 m L的100 m Os M低滲溶液（9 g／L果糖和4.9 g／L檸檬酸鈉）中［20-21］，37 ℃孵育60 min。取0.2 m L精液涂片，在1000×顯微鏡視野下觀察200枚精子，統(tǒng)計(jì)腫脹或翹尾巴精子。

1.4.5 谷胱甘肽濃度測(cè)定 取3.0×108個(gè)／m L的精液1 m L，添加等體積50%三氯乙酸，然后800×g離心6 min，取上清液0.5 m L與2 m L的0.2 mol／L tris-緩沖液（p H 8.9）和0.5 m L 的0.01 mol／L 55-二硫雙硝基對(duì)苯甲酸混合，室溫保存5 min，然后分光度計(jì)412 nm測(cè)定谷胱甘肽的濃度（nmol／m L）。

1.4.6 精子質(zhì)膜氧化測(cè)定 取3.0×108個(gè)／m L精液1 m L，加入預(yù)冷20%（w：v）三氯乙酸，1600×g離心10 min，取1 m L上清液與1 m L的0.67%（w：v）硫代巴比妥酸（TBA）混合，100℃水域10 min，冷卻后，分光度計(jì)534 nm測(cè)定定丙二醛（MDA）濃度（nmol／m L）。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 冷凍稀釋液I中MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度的影響 分別用含0、3、6、9、12、15 mg／L的 MCRP冷凍稀釋液I稀釋（表1），平衡2 h后，按照稀釋精液與稀釋液II體積比為2：1進(jìn)一步稀釋，最終混合精液中MCRP濃度為0、2、4、6、8、10 mg／L。精液冷凍解凍后，分別測(cè)定精子相關(guān)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度。

1.5.2 冷凍稀釋液II中MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度的影響 用冷凍稀釋液I（表1）稀釋后，平衡2 h，按照稀釋精液與冷凍稀釋液II體積比為2：1進(jìn)一步稀釋，稀釋液II中MCRP濃度分別為0、6、12、18、24、30 mg／L，混合后精液中MCRP的最終濃度為0、2、4、6、8、10 mg／L。精液冷凍解凍后，測(cè)定精子相關(guān)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度。

1.5.3 稀釋液I或稀釋液II中MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度的影響 每頭豬精液分成三等份后單獨(dú)處理，第1份精液用含9 mg／L MCRP稀釋液I稀釋，平衡2 h，再用稀釋液II稀釋；第2份先用稀釋液I稀釋，平衡2 h，再用含有18 mg／L MCRP稀釋液II稀釋；第3份先用含4.5 mg／L MCRP稀釋液I稀釋，平衡2 h，再用含有9 mg／L MCRP稀釋液II稀釋；混合油后精液中MCRP最終濃度都為6 mg／L，混合精液冷凍解凍后，測(cè)定精子相關(guān)參數(shù)、谷胱甘肽和MDA濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Kolgomorov-Smirnov檢驗(yàn)均為正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析檢驗(yàn)差異顯著后，使用多重比較使用Duncan＇s檢驗(yàn)；MCRP濃度與精子冷凍解凍后各參數(shù)之間的相關(guān)性使用皮爾遜檢驗(yàn)。以上數(shù)據(jù)分析借助SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性水平全部設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCRP對(duì)豬精子冷凍解凍后運(yùn)動(dòng)特征的影響

用三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)并借助計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)，研究了MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。結(jié)果見(jiàn)表2～5。由表2知，精子活率隨著MCRP濃度的增加而增加，當(dāng)MCRP濃度超過(guò)4 mg／L時(shí)，精子活率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；活精子總數(shù)（To-tal motile sperm，TM）、線性運(yùn)動(dòng)精子（liner motile sperm，LM）和超活躍精子（Hyperactive sperm，Hyp）均表明 MCRP最佳濃度是6 mg／L（P＜0.05）；MCRP濃度與TM 和LM 顯著相關(guān)（P＜0.05），但與 Hyp無(wú)相關(guān)性（P＞0.05，表4），而且6 mg／L和8 mg／L組的TM、LM和Hyp高于其它濃度組（P＜0.05）。由表5可知，A組和C組的TM和LM顯著高于B組（P＜0.05），但Hyp各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 稀釋液I中MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、線粒體活性、頂體完整性、HOST以及精液中谷胱甘肽和MAD濃度的影響Table 2 Effects of MCRP in extender I on motion parameter，mitochondrial activity，acrosome integrity，HOST，and concentrations of GSH and MAD of frozen-thawed boar semen

2.2 MCRP對(duì)豬精子冷凍解凍后線粒體活性的影響

豬精子凍后線粒體活性（mitochondrial activity，MA）隨MCRP濃度增加而升高。表4表明，線粒體活性與 MCRP濃度顯著相關(guān)（P＜0.05）。由表2知，當(dāng)MCRP濃度高于4 mg／L時(shí)試驗(yàn)組線粒體活性高于對(duì)照組（P＜0.05）；由表3知，當(dāng)MCRP濃度大于6 mg／L時(shí)，線粒體活性試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由表5知，豬精子線粒體活性B組低于A組和C組（P＜0.05）。

表3 稀釋液II中MCRP對(duì)凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、線粒體活性、頂體完整性、HOST以及精液中谷胱甘肽和MAD濃度的影響Table 3 Effects of MCRP in extender II on motion parameter，mitochondrial activity，acrosome integrity，HOST，and concentrations of GSH and MAD of frozen-thawed boar semen

表4 稀釋液I和稀釋液II中MCRP濃度與凍后精子各參數(shù)相關(guān)性Table 4 Relationships between MCRP concentration and seminal parameters in extender I and II

2.3 MCRP對(duì)豬精子冷凍解凍后頂體完整性和質(zhì)膜完整性的影響

由表2可見(jiàn)，精子MCRP組頂體完整性（acrosome integrity，AI）均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），精子質(zhì)膜完整性只有MCRP濃度高于濃度6 mg／L時(shí)才顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；另外，MCRP濃度與AI之間無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05），但與質(zhì)膜完整性之間顯著相關(guān)（P＜0.05，表4）；由表3可見(jiàn)，MCRP濃度高于6 mg／L時(shí)，AI和質(zhì)膜完整性均顯著高于照組（P＜0.05），且質(zhì)膜完整性和AI均與MCRP濃度之間存在顯著相關(guān)（P＜0.05）。由表5知，B組質(zhì)膜完整性低于A組和C組（P＜0.05），而A組AI顯著高于B和C（P＜0.05）。

2.4 MCRP對(duì)豬精液冷凍解凍后谷胱甘肽和丙二醛濃度的影響

由表4知，MCRP濃度與谷胱甘肽（GSH）之間存在正相關(guān)性（P＜0.05），隨著 MCRP濃度增加，冷凍凍后精液中GSH濃度逐漸升高趨勢(shì)，而且MCRP濃度超過(guò)4 mg／L（表2）或6 mg／L（表3）時(shí)，精液中谷胱甘肽的濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。另外，試驗(yàn)結(jié)果表明，冷凍解凍精液丙二醛（MDA）濃度與 MCRP濃度成負(fù)相關(guān)（P＜0.05，表4），且MCRP濃度超過(guò)6 mg／L時(shí)，精液MDA濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，表2，表3）。B組 MDA濃度顯著高于A組和C組（P＜0.05），但B組GSH濃度顯著低于A組和C組（P＜0.05）。

表5 MCRP在稀釋液I和稀釋液II中MCRP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、線粒體活性、頂體完整性、HOST以及精液中谷胱甘肽和MAD濃度的影響Table 5 Comparison of MCRP effects in extender I and II on motion parameters，mitochondrial activity，acrosome integrity，HOST，and concentrations of GSH and MAD of frozen-thawed boar semen

3 討 論

Zhao等［9］研究表明，紅景天粗多糖能夠降低凍后豬精液中ROS，顯著提高精子凍后質(zhì)量，但是目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)利用MCRP保護(hù)哺乳動(dòng)物精子的相關(guān)報(bào)道，本研究將MCRP添加冷凍保護(hù)稀釋液I和稀釋液II中，通過(guò)對(duì)冷凍解凍后精液中谷胱甘肽、丙二醛、精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及精子質(zhì)膜等進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)MCRP在4～6 mg／L濃度范圍內(nèi)具有良好的效果，而且在稀釋液I中效果優(yōu)于稀釋液II，這一結(jié)果與Zhao等［9］在冷凍稀釋液中添加紅景天粗多糖的結(jié)果基本相似。

精液冷凍保存過(guò)程可以使精液中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶損耗減少，相對(duì)而言精液中谷胱甘肽過(guò)氧化酶就會(huì)過(guò)剩，這導(dǎo)致精液中谷胱甘肽濃度降低，而且谷胱甘肽還原酶的損耗或其酶活性的降低還會(huì)造成冷凍解凍過(guò)程中精子產(chǎn)生谷胱甘肽能力的降低［12］，同時(shí)冷凍解凍過(guò)程誘發(fā)ROS大量產(chǎn)生進(jìn)一步損耗谷胱甘肽，富余的ROS就會(huì)富集于精子表面損傷精子質(zhì)膜，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。另外，本研究顯示MCRP濃度與谷胱甘肽之間存在顯著地正相關(guān)性（P＜0.05，表5），可以推斷 MCRP有助于細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度的增加，谷胱甘肽作用于谷胱甘肽過(guò)氧化酶和ROS，從而阻止對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的誘導(dǎo)氧化［8］。類似的研究將紅景天粗多糖添加到人紅細(xì)胞培養(yǎng)液中，能夠增加人紅細(xì)胞中谷胱甘肽的濃度［13］。精子冷凍保存過(guò)程打破了精液中抗氧化與氧化平衡系統(tǒng)，精子產(chǎn)生的負(fù)氧離子自由基聚集在精子表面，從而化了精子質(zhì)膜上的不飽和脂肪酸，形成細(xì)胞氧化次生品MDA［13］，本研究表明，冷凍解凍后精液中丙二醛濃度與MCRP呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，R＝-0.982），推測(cè) MCRP能夠有效地清除精液中的負(fù)氧離子自由基，并能夠抑制質(zhì)膜的過(guò)氧化。類似報(bào)道表明，MCRP能顯著降低肝細(xì)胞中MDA 的濃度［14］。

本研究分別將MCRP添加到冷凍稀釋液I和稀釋液II觀察其對(duì)精子各項(xiàng)參數(shù)的影響。研究結(jié)果表明MCRP添加到稀釋液I比添加到稀釋液II更能改善精子各項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)MCRP添加到稀釋液I時(shí)，整個(gè)冷凍保存過(guò)程的精子都受到MCRP抗氧化保護(hù)，將MCRP只添加到稀釋液II中，精子在稀釋液I平衡過(guò)程中未受到MCRP保護(hù)抗氧化，負(fù)氧離子自由基損傷精子質(zhì)膜，致使精子在冷凍前質(zhì)量有所下降，而且冷凍前精子的質(zhì)量顯著影響精子冷凍后的質(zhì)量［15-16］，因而MCRP添加到稀釋液I比添加到稀釋液II更能改善精子各項(xiàng)指標(biāo)，上述推理也得到本研究相關(guān)試驗(yàn)的充分驗(yàn)證（表5）。與本研究類似的報(bào)道如在冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽或者維生素E能夠提高精子的運(yùn)動(dòng)性能［12，17］。在缺少抗氧化物質(zhì)的條件下，精子有氧呼吸產(chǎn)生的ROS將會(huì)抑制線粒體活性，最終導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力的下降［18］。本研究顯示，在冷凍稀釋液中添加4～6 mg／L的MCRP能夠提高精子的運(yùn)動(dòng)能力，而且精子MA與MCRP濃度之間存在顯著地正相關(guān)。但是，值得注意的當(dāng)MCRP的濃度超過(guò)6 mg／L時(shí)，精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)呈下降趨勢(shì)。本研究認(rèn)為過(guò)高的MCRP可能會(huì)抑制在冷凍保存過(guò)程中精子正常生理活動(dòng)產(chǎn)生的ROS，從而抑制了精子的運(yùn)動(dòng)能力。相關(guān)報(bào)道也表示在豬精子冷凍保存液中，過(guò)多加入抗氧化劑成分，將會(huì)過(guò)度中和精液中的ROS或者抑制其產(chǎn)生，從而導(dǎo)致與ROS相關(guān)的精子生理功能的缺失［19-20］，致使精子運(yùn)動(dòng)性能下降。

精液中過(guò)多的ROS可能會(huì)引起精子質(zhì)膜、精子頂體和線粒體超顯微結(jié)構(gòu)的改變和功能的損傷［21-22］，本研究表明 MCRP濃度大于6 mg／L，能夠有效地增加HOST比例、頂體完整性和線粒體活性精子的比例，精子有氧呼吸中產(chǎn)生ROS的位置目前集中在兩個(gè)位置，分別是精子質(zhì)膜和線粒體，如果冷凍保存液中抗氧化成分的含量不足，過(guò)多的ROS首先會(huì)攻擊線粒體膜和精子質(zhì)膜，而精子質(zhì)膜和線粒體膜上有豐富的非飽和脂肪酸很容易被氧化［2，22］。當(dāng)MCRP添加到冷凍保存稀釋液中后，就能夠有效地清除多余的ROS，保護(hù)了精子質(zhì)膜、頂體和線粒體活性，從而提高了精子冷凍保存后的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

MCRP在豬精子冷凍保存稀釋液中最佳添加濃度為4～6 mg／L。在豬精子冷凍保存過(guò)程中，MCRP添加到稀釋液I的效果優(yōu)于稀釋液II。豬精子冷凍保存中，MCRP抗氧化性效果與濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性。

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