蔡 明，牟 蘭，張美艷，王宗禮，黃必志＊

（1.云南農業(yè)大學 動 物科技學院，云南 昆 明650201；2.蘭州大學 草 地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭 州730020；3.云南省草地動物科學研究院，云南 昆 明650212）

紅三葉（Trifolium pratense L.）是世界上重要的豆科牧草之一，不但群落適應性強、產量高而且莖葉柔軟，適口性好，蛋白質含量占干物質的25%以上，各類家畜都喜采食，對改善家畜肉品質具有重要作用［1-3］?；凶饔弥饕侵钢参锿ㄟ^莖葉揮發(fā)、淋溶、根系分泌等途徑向環(huán)境中釋放化學物質并對其他植物或者自身產生促進和抑制的作用［4-8］，是一種極其復雜的自然生態(tài)現(xiàn)象。紅三葉具有極強的化感作用，其會分泌出多種異黃酮類物質，這些物質會從植物的不同部位釋放到環(huán)境當中，對植物的生長發(fā)育起抑制作用，因此紅三葉常形成較強的群落，不但排擠其他牧草，而且對自身也有影響［5，7］。當受體和供體屬于同一種植物時，所產生的抑制作用現(xiàn)象，稱為植物的自毒作用，它是植物種內相互影響的方式之一，是一種特殊的化感作用。近年來，國內有關水稻［9-10］、小麥［11-13］、甘蔗［14］、煙草［15］等植物化感作用的研究報道較多，而對紅三葉自毒作用的研究鮮有報道。

本試驗以北亞熱帶區(qū)昆明小哨牧場廣泛栽培利用的小哨紅三葉（莖、葉、花）三個部位浸提液為處理，研究了其對自身種子發(fā)育的影響，通過生物檢測方法對紅三葉的自毒作用進行了初步研究，確定其是否對自身種子發(fā)育具有自毒影響以及影響強度大小，以期為北亞熱帶地區(qū)建立優(yōu)化的紅三葉間作、混作、套種模式及優(yōu)質高產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供體植物為小哨紅三葉（Triflium pretense L.），于2013年8月初采集于云南省草地動物科學研究院小哨示范草場，此時紅三葉處于開花初期。受體種子為小哨紅三葉種子，于2012年采于小哨試驗基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅三葉莖、葉、花收集及浸提液的制備 挖取營養(yǎng)生長期生長健壯的紅三葉新鮮植株，迅速分開植株莖、葉、花，刷干凈灰土，剔除枯黃葉和老枝干，剪切5 mm左右小段；處理好的莖、葉、花稱重后分別放入錐形瓶，按1 g鮮重材料：4 m L水的比例用無菌蒸餾水在18～20℃室溫下震蕩浸泡48 h，然后用3層滅菌紗布和雙層濾紙過濾，再用0.45 μm微孔濾膜過濾得到濃度為0.25 g／m L的浸提液母液。將母液分別用無菌蒸餾水稀釋為0.025 g／m L、0.05 g／m L、0.075 g／m L、0.1 g／m L、0.15 g／m L、0.20 g／m L濃度后保存于4℃冰箱。培養(yǎng)皿（Φ9 cm）和濾紙滅菌，每個培養(yǎng)皿鋪2層濾紙，分別加入5 m L各濃度浸提液，無菌蒸餾水為對照。

1.2.2 種子萌發(fā)進行生物檢測 選擇顆粒飽滿、大小均勻的紅三葉種子用10%的 H2O2消毒5 min，再用無菌蒸餾水沖洗干凈，均勻排列于培養(yǎng)皿內，每皿50粒，上蓋，封口膜封好邊緣，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽。每日固定補充適量紅三葉水浸提液或無菌蒸餾水1次，每個處理3次重復，并統(tǒng)計下胚軸長、幼根長和幼苗長。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

化感指數(shù) RI＝1-C／T（當T≧C時）；RI＝T／C-1（當T＜C時），上式中：C指對照值，T指處理值，RI＞0表示促進作用，RI＜0表示抑制作用，RI絕對值的大小與化感作用強度一致。

用SPSS20.0進行單因子方差分析（One-way ANOVA）和Duncan描述法分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 紅三葉莖浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

試驗結果（表1）表明，不同濃度的莖浸提液處理紅三葉種子，種子的下胚軸長、幼根長和幼苗長受到不同程度的促進和抑制作用。其中：下胚軸在不同濃度處理下均表現(xiàn)為促進作用，0.15 g／m L濃度的莖浸提液促進作用較大，化感指數(shù)為0.20，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.10 g／m L濃度處理下的下胚軸長差異顯著（P＜0.05）。不同濃度的莖浸提液對幼根和幼苗均產生不同程度的抑制作用，（0.025～0.20 g／m L）濃度下，隨著濃度增加，抑制作用不斷增強；最高濃度0.20 g／m L的對幼根的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.60，與對照差異極顯著，與0.15 g／m L差異不顯著（P＞0.05），而與其余濃度差異極顯著（P＜0.01）；最高濃度0.20 g／m L對幼苗的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.34，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與低濃度0.025 g／m L、0.050 g／m L差異極顯著（P＜0.01）。說明莖浸提液對幼根長的化感影響強度大于幼苗長。

表1 紅三葉莖浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 1 The effect of red clover stem extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

2.2 紅三葉葉浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

從表2可以看出，不同濃度的葉浸提液對紅三葉種子下胚軸長、幼根長和幼苗長產生了不同的影響，對下胚軸長均產生了促進作用，而對幼根長和苗長產生了抑制作用。其中：0.10 g／m L對下胚軸長的促進作用最大，化感指數(shù)是0.29，與對照差異極顯著，且與0.025 g／m L、0.050 g／m L差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的葉浸提液對幼根長均產生了抑制作用，（0.075～0.20 g／m L）濃度區(qū)間，抑制作用隨濃度的加大，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最大，化感指數(shù)為-0.69，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與除0.050 g／m L濃度的其余處理差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的葉浸提液對幼苗長均表現(xiàn)為不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）濃度區(qū)間，抑制作用隨著濃度的加大，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最大，化感指數(shù)為-0.39，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L、0.15g／m L濃度的幼苗影響差異極顯著（P＜0.01）。說明葉浸提液對幼根長的化感影響大于幼苗長。

表2 紅三葉葉浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 2 The effect of red clover leaf extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

2.3 花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響

試驗（表3）表明，不同濃度的花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長產生了不同影響，既有促進作用又有抑制作用。其中：花浸提液對下胚軸長表現(xiàn)為促進作用，最大濃度0.20 g／m L的促進作用最明顯，化感指數(shù)為0.21，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與 0.15 g／m L 濃度差異顯著 （P＜0.05）；在（0.025～0.10 g／m L）濃度區(qū)間，隨著濃度的增加，促進作用不斷加強。不同濃度的花浸提液對幼根長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.63，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.050 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L濃度下的幼根長差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的花浸提液對紅三葉幼苗長均產生了抑制影響，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.31，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025、0.050 g／m L濃度下的幼苗差異極顯著（P＜0.01）。花浸提液對幼根長的化感影響大于幼苗長。

表3 紅三葉花浸提液對下胚軸長、幼根長和幼苗長的影響Table 3 The effect of red clover flower extracts on hypocotyl，radicle and seedling length

試驗（表3）表明，不同濃度的花浸提液對紅三葉下胚軸長、幼根長和幼苗長產生了不同影響，既有促進作用又有抑制作用。其中：花浸提液對下胚軸長表現(xiàn)為促進作用，最大濃度0.20 g／m L的促進作用最明顯，化感指數(shù)為0.21，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與 0.15 g／m L 濃度差異顯著 （P＜0.05）；在（0.025～0.10 g／m L）濃度區(qū)間，隨著濃度的增加，促進作用不斷加強。不同濃度的花浸提液對幼根長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.63，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025 g／m L、0.050 g／m L、0.075 g／m L、0.10 g／m L濃度下的幼根長差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的花浸提液對紅三葉幼苗長均產生了抑制影響，（0.10～0.20 g／m L）區(qū)間，表現(xiàn)為隨著濃度的增加，抑制作用不斷增強，最高濃度0.20 g／m L的抑制作用最強，化感指數(shù)為-0.31，與對照差異極顯著（P＜0.01），且與0.025、0.050 g／m L濃度下的幼苗差異極顯著（P＜0.01）?；ń嵋簩τ赘L的化感影響大于幼苗長。

3 討 論

本試驗以紅三葉為供體材料，通過對其種子的科學生物檢測，統(tǒng)計分析不同部位浸提液對其種子下胚軸長、幼根長和幼苗長這三個指標的化感作用，證實了紅三葉不同部位能夠產生多種自毒物質影響自身種子生長發(fā)育。本研究表明，紅三葉具有自毒作用，與對照相比，不同濃度的紅三葉各部位（莖、葉、花）浸提液對其種子生長發(fā)育產生了不同程度的影響，既有促進作用，又有抑制作用，與前人的研究結果一致［16-18］。關于植物不同部位浸提液不同濃度處理間的化感效應差異的問題，本試驗顯示只有當浸提液處理濃度達到某一臨界點時，才會產生明顯的化感抑制作用，低于這一濃度時紅三葉不受損壞，且部分化感物質會對其生長產生一定的促進作用，李志華等［17，19-20］的研究也得出了類似的結果。此外，試驗結果還揭示了不同部位的浸提液對種子幼根和幼苗的化感作用表現(xiàn)出一定的濃度效應，莖浸提液在（0.025～0.20 g／m L）濃度下，隨著濃度增加，對幼根和幼苗抑制作用不斷增強，葉、花浸提液在（0.10～0.20 g／m L）濃度下均表現(xiàn)出此種濃度效應現(xiàn)象。

紅三葉不同部位浸提液對下胚軸長產生了促進作用，說明部分自毒物質在一定濃度下會產生促進植物生長的效應。本研究顯示，不同部位的浸提液的促進作用強度不同，如莖浸提液0.15 g／m L對下胚軸長的促進作用最大，而葉、花浸提液對下胚軸長的促進作用最大的分別是0.10和0.20g／m L浸提液。這些差異顯然不單單是化感物質濃度高低引起的，可能還與紅三葉不同部位分泌的自毒物質種類差異有關。與下胚軸長所受浸提液促進作用不同的是，幼根長和幼苗長均受到了不同程度的抑制作用，且幼根受抑作用較幼苗大。試驗過程中，受抑作用大的種子不僅根毛減少，而且根部出現(xiàn)上翻的敗育現(xiàn)象，說明紅三葉浸提液中的自毒物質是通過抑制根的發(fā)育，影響根部對營養(yǎng)和水分的吸收，從而抑制幼苗的生長，最終導致地上生物量下降。

植物種子萌發(fā)的過程是一個極其復雜的過程，室內試驗條件和自然條件狀態(tài)是不同的，紅三葉在自然狀況下由于受到熱量、水分、土壤等因素的影響［21-22］，紅三葉的自毒作用強度也會有所不同，大部分化感物質是要通過枯枝敗葉腐爛分解并經過復雜的土壤轉化過程才逐步釋放的，故今后還需加強砂培試驗，做進一步研究。

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