趙春萍，曹 婷，施力光，張立嶺，侯冠彧＊

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州571737；2.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 海口570228）

RNA 干擾（RNA interterence，RNAi）具有高度保守的特點(diǎn)，普遍存在于動植物體內(nèi)，是由雙鏈RNA引起的特異性沉默靶基因的免疫應(yīng)答反應(yīng)。RNAi技術(shù)能特異性抑制生物體內(nèi)源功能基因的表達(dá)，進(jìn)而通過表型或生理生化指標(biāo)的變化來反映該基因的功能。隨著基因組測序工作的完成，我們也逐漸進(jìn)入了后基因組時代，基因的功能分析已成為現(xiàn)在的科研重點(diǎn)。自發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象普遍存在線蟲、果蠅、小鼠和植物等生物體內(nèi)以來，RNAi已發(fā)展成為一種簡便、快速、高效的分析基因組功能的有力工具，也為由基因到功能的反向遺傳學(xué)途徑提供了功能研究的橋梁。

在哺乳動物中，研究基因組功能最為常用的方法是通過同源重組進(jìn)行基因打靶（Gene target）達(dá)到基因敲除（Knock out）的目的，但是這種方法往往會造成細(xì)胞凋亡，而且也不適用于未建立胚胎干細(xì)胞的動物。同時，基因打靶也存在操作難、周期長等缺點(diǎn)。在線蟲、果蠅和植物中，RNAi成功應(yīng)用的長雙鏈RNA（＞29 bp）又不可避免干擾素效應(yīng)導(dǎo)致的全面關(guān)閉蛋白合成的后果［1］。2001年，Caplen等［2］和Elbashir等［3］發(fā)現(xiàn)短至21～22 nt的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）能夠在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)有效的RNAi，而不誘發(fā)干擾素反應(yīng)。這一研究的發(fā)現(xiàn)全面開啟了RNAi技術(shù)在哺乳動物中應(yīng)用的新篇章。本文主要針對近幾年RNAi在畜禽方面的研究進(jìn)展做出總結(jié)與展望。

1 RNAi機(jī)制

隨著RNAi生化和遺傳學(xué)知識、數(shù)據(jù)的積累，科學(xué)家們已證實(shí)RNAi是由dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程，但其真正的機(jī)理暫時還不清楚。目前認(rèn)為一般分為以下幾個步驟：

起始階段：dsRNA進(jìn)入細(xì)胞→由Dicer核酸酶特異性識別→借助ATP功能的形式切割dsRNA→得到21～23 nt（或bp）的同源小片段siRNA，siRNA與mRNA→識別目標(biāo)mRNA→啟動RNAi反應(yīng)。

效應(yīng)階段：siRNA與核酸酶等蛋白質(zhì)結(jié)合→形成RNA→誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）→依靠ATP提供能量解開siRNA雙鏈→激活RISC→活化后的RISC定位到于siRNA中的反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上→在距離siRNA 3′端12個堿基的位置切割m RNA→降解靶 mRNA［4］。

放大階段：被降解的mRNA片段，在RNA聚合酶的作用下，形成小雙鏈RNA加入到RNAi的起始階段，從而起到了放大的作用。此過程如圖1所示。

圖1 RNAi作用機(jī)理示意圖Fig.1 RNAi mechanism schematic diagram

RNAi的小非編碼片段主要有三種：piRNAs（PIWI-interacting RNAs）miRNAs（microRNAs），和siRNAs（small interfering RNA）［5］。其中 piRNAs和miRNAs屬內(nèi)源性，由機(jī)體內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄加工形成的非編碼RNA小片段。而siRNAs一直被認(rèn)為是專門處理外源致病RNA（比如病毒）的片段，但隨著在動物細(xì)胞內(nèi)大量內(nèi)源性siRNAs表達(dá)的發(fā)現(xiàn)使這一觀點(diǎn)有所改變［6-7］。目前在哺乳動物體內(nèi)已知有數(shù)以千計的piRNAs由成簇的重復(fù)序列編碼產(chǎn)生，同時還有超過1000種的miRNAs，這些數(shù)據(jù)并不完善，還需要進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)確定。在RNAi的起始階段，RNAi前體要經(jīng)過一系列酶切過程才能形成有效的RNA片段，進(jìn)而與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RISC。參與miRNAs加工的酶主要有RNAse III蛋白Drosha和Dicer，siRNAs僅依靠Dicer，而加工piRNAs的核酸酶現(xiàn)在還不確定［8］。miRNA-RISC和siRNA-RISC的主要蛋白是AGO（Argonaute proteins）蛋白，piRNA-RISC的是PIWI蛋白。在沉默復(fù)合體中，RNAi的指導(dǎo)鏈與靶m RNA鏈存在著完全和不完全配對兩種形式，miRNA為不完全配對，其他兩種則執(zhí)行完全配對原則。miRNA的這種配對方式也導(dǎo)致其具有更廣泛的沉默范圍。

2 RNAi在畜禽傳染性疾病方面的應(yīng)用

畜牧業(yè)是人類重要食物、經(jīng)濟(jì)來源的支柱產(chǎn)業(yè)之一，然而病毒性疾病以其發(fā)病快，影響大等特點(diǎn)嚴(yán)重影響其穩(wěn)步快速的發(fā)展，有些病毒不僅能在畜禽中傳播，甚至可以在人類中發(fā)病，嚴(yán)重的能導(dǎo)致死亡。面對這些病毒，科研人員往往利用抗體來治療。但是抗體具有高度特異性，只能針對某種抗原。而病毒在傳播過程中，通常會對這些藥物產(chǎn)生耐藥性，即通過本身的基因變異來躲避抗體。病毒的變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗體的制備速度，而病毒在宿主體增殖過程中，都要經(jīng)過m RNA過程來翻譯蛋白質(zhì)，這樣便能利用RNAi技術(shù)來預(yù)防和控制病毒的傳播。

2.1 在豬瘟中的應(yīng)用

豬瘟病以其高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，并被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須上報的動物傳染病之一，同時我國也將其列為一類動物傳染病。目前，在對抗豬瘟主要應(yīng)用兔化弱毒疫苗，但其效果越來越不理想。Li等［9］以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的NS3、Npro、NS5B為靶基因分別設(shè)計siRNA序列，構(gòu)建使用相同或四個不同啟動子的單、雙和四siRNA表達(dá)質(zhì)粒，與NS3、Npro、NS5B表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，通過RT-PCR和熒光蛋白的表達(dá)檢測siRNA的抑制效果。結(jié)果表明，單個或多個siRNA表達(dá)質(zhì)粒都可以有效地抑制CSFV復(fù)制，然而針對不同基因表達(dá)的多個siRNAs質(zhì)粒載體明顯具有更強(qiáng)的抑制效果。這一研究為更有效的治療豬瘟提供了一定的理論基礎(chǔ)。宋紅芹等［10］針對非洲豬瘟 病 毒 （African swine fever virus，ASFV）NP419L基因設(shè)計的5對shRNA干擾序列也得到了良好的抑制效果，其中兩對干擾效率達(dá)到87%以上，其他三對存在顯著性差異（P＜0.05）。為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

目前的研究表明，siRNA作為一種抑制CSFV的有效制劑，雖然不能完全抑制病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制，但也可以降低其增殖速度，為激活自身機(jī)體免疫效應(yīng)爭取時間，同時也為新型抗CSFV藥物的研制提供了參考。

2.2 在口蹄疫中的應(yīng)用

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）因?yàn)閭鞑パ杆?、發(fā)病率高的特點(diǎn)嚴(yán)重影響了偶蹄動物的養(yǎng)殖，該病廣泛流行于世界各國，已被OIE列為A類家畜傳染病之首，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為第一類動物疫病的第一病。Ke等［11］以口蹄疫病毒（Footand-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）VP1基因?yàn)榘心繕?biāo)，設(shè)計并篩選出了5條效率較高的特異性siRNA片段。用這5條siRNA片段分別與報告基因共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA只能短暫性抑制FMDV的復(fù)制，48小時后都出現(xiàn)了CPE現(xiàn)象，提取RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)VP1出現(xiàn)了單核苷酸轉(zhuǎn)換，從而增強(qiáng)了RNAi抗性。Cong等［12］針對FMDV高度保守的3D，VP4和2B基因序列設(shè)計siRNA，構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，與FMVD共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)siRNA有較高的抑制效果，將siRNA表達(dá)質(zhì)粒注入到已感染的乳鼠中，結(jié)果延遲了乳鼠的死亡。隨后以弱毒的S.choleraesuis為siRNA表達(dá)質(zhì)粒的載體，與FMDV分別感染guinea pigs和swine都起到了良好的保護(hù)效果。研究顯示，弱毒的S.choleraesuis因其成本低且對豬具有安全性的特點(diǎn)從而可以作為RNAi的遞呈系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)。目前沒有一種疫苗或藥劑可以完全、快速、有效的抑制FMD。所以Kim等［13］結(jié)合抗病毒藥劑和siRNA共同抑制FMD。結(jié)果表明，重組腺病毒siRNA表達(dá)載體與ribavirin混合使用可以明顯增強(qiáng)對FMDV的抑制效果，其效率高于單獨(dú)使用其中的任意一種。

口蹄疫病毒可分為7個血清型，且型間沒有交叉保護(hù)作用，用疫苗治療口蹄疫并不能得到很好的療效。近年來的研究表明，RNAi技術(shù)作為一種新的基因治療手段，可以有效的抑制病毒，而且當(dāng)與抗病毒藥劑結(jié)合使用時，可以起到更好的效果。

2.3 在朊病毒中的應(yīng)用

朊病毒是由內(nèi)源性朊蛋白基因（prion protein gene，prnp）編碼的朊蛋白（prion protein，PrP），正常細(xì)胞都會轉(zhuǎn)錄翻譯該蛋白質(zhì)。該病毒可導(dǎo)致海綿狀腦病，主要包括瘋牛病、一些羊病、鹿病、人的克雅氏癥（Creuzfeldt-Jacob disease，CJD）、吉斯特曼-斯召斯列綜合癥（Gerstmann-Straussler syndrome，GSS）、庫魯癥（Kuru）等。Mallucci等［14］研究表明敲除PrPc的轉(zhuǎn)基因小鼠可以抵抗朊蛋白病，并且Pr P產(chǎn)量減少一半的動物可以抵抗瘋牛病。由于Pr P的功能尚不完全清楚，敲除該基因可能會有副作用，而RNAi途徑正好可以避免這問題的發(fā)生。Li等［15］構(gòu)建了山羊prnp基因和針對該基因的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，兩者共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后經(jīng)RTPCR檢測prnp的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒載體可以有效的介導(dǎo)和表達(dá)siRNA，并達(dá)到抑制的效果。而Michael等［16］利用慢病毒介導(dǎo)的sh RNA表達(dá)載體感染山羊成纖維細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，又以此細(xì)胞為核供體細(xì)胞，進(jìn)行體細(xì)胞和移植獲得轉(zhuǎn)基因胎兒，利用RT-PCR和 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，胎兒的所有組織的prnp基因表達(dá)都被敲低。隨后以同樣的方法應(yīng)用在?？苿游锷系玫搅送瑯拥男Ч?。該方法可以應(yīng)用到家畜朊病毒的預(yù)防。

目前RNAi技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到畜禽傳染性疾病的各個方面，其主要方向是針對某種病的致病病毒的必須蛋白的基因的高度保守序列設(shè)計sh RNA片段，并構(gòu)建表達(dá)載體，利用慢病毒或腺病毒介導(dǎo)，將sh RNA整合到動物基因組中，最后應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得具有抗病基因的轉(zhuǎn)基因動物。

2.4 在新城疫病毒中的應(yīng)用

新城疫（Newcastle disease，ND）是造成禽類養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要病癥之一，該病由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引發(fā)，NDV 是單鏈的負(fù)鏈RNA病毒，基因組總長度大約為15Kb，又稱一型禽副粘病毒（avian paramyxovirus type 1，AMPV-1）。主要編碼六種蛋白質(zhì)：核蛋白（NP），磷蛋白或 V蛋白（P／V），基質(zhì)蛋白（M），融合糖蛋白（F），haemagglutinin neuraminidase glycoprotein（HN），大聚合酶蛋白（L），其順序?yàn)椋?-NP-P-M-FHN-L-5＇。根據(jù)NDV對鳥類致病性程度可將其分為強(qiáng)毒型、中毒型和弱毒型三種。M蛋白是NDV編碼六個蛋白中最小的一個，其主要是構(gòu)成病毒核蛋白的內(nèi)部囊膜。Yin等［17］針對M基因的641和827位點(diǎn)設(shè)計了sh RNA，分別命名為pSM641和pSM827，并得到了較好的抑制效果，其中pSM641的抑制效率高達(dá)94.6%，并顯著的降低了CPE的出現(xiàn)。這一結(jié)果表明RNAi針對M基因不僅可以作為有效的抗病治療方法也可以作為研究DNV復(fù)制的輔助方法。YUE等［18］針對NP基因設(shè)計的sh RNA同樣也得到了良好的抑制的效果，其中最高的抑制效率高達(dá)94.14%。

迄今為止，越來越多的研究表明RNAi作為動植物抗病毒藥物制劑具有良好的效果和廣闊的前景，但是其中大部分為體外研究，而體內(nèi)研究很少。讓RNAi完全的發(fā)揮其治療的作用的關(guān)鍵是怎么高效地將RNAi片段遞呈到靶細(xì)胞。遞呈RNA片段的過程中主要存在兩個問題。首先是生理學(xué)方面的障礙，如siRNA要經(jīng)過血液到達(dá)靶器官，在經(jīng)過血管到細(xì)胞間質(zhì)，接著越過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，最后通過核膜到達(dá)細(xì)胞核中。第二個就是外源RNA片段本身的穩(wěn)定性問題，如在人血液中siRNA和裸露質(zhì)粒的半衰期只有幾分鐘［19-20］。目前主要從生物、化學(xué)和物理三面來解決這些問題。生物學(xué)方法主要是利用病毒載體，如慢病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體。病毒載體在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)都具有高效的沉默效率［21-23］，但是仍存在著具有免疫原性，毒性和引起宿主細(xì)胞基因組插入突變，不能大量表達(dá)病毒載體等缺陷［24-25］?；瘜W(xué)方法主要是陽離子復(fù)合物包被RNAi片段，這種方法主要是應(yīng)用與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而該方法最大的問題是具有一定的細(xì)胞毒性［26］。物理方法是直接干擾細(xì)胞質(zhì)膜讓RNAi和質(zhì)粒通過。目前主要是通過流體力學(xué)，射擊法，滲透法，超聲波和電場微調(diào)法來實(shí)現(xiàn)遞呈，這些方法目前還是應(yīng)用與體外研究，也許有希望應(yīng)用與體內(nèi)研究。作為抗病毒藥劑要不僅要有良好的治療效果，而且還要對機(jī)體沒有傷害，生物學(xué)方法雖然有較好的效果，但是對機(jī)體健康還是有一定風(fēng)險的，物理和化學(xué)方法還不能應(yīng)用與體內(nèi)，由此可見，RNAi作為一種抗病毒藥劑還需要很長的一段路程。

3 RNAi在改善畜禽生產(chǎn)性狀的應(yīng)用

隨著社會經(jīng)濟(jì)與科技的飛速發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對畜產(chǎn)品的品質(zhì)要求和需求量愈發(fā)增加。提高豬、牛、羊的產(chǎn)肉性能和畜產(chǎn)品的品質(zhì)現(xiàn)已成為科學(xué)研究者、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者最為關(guān)心的問題。

雙肌牛因其特有的飼料報酬高、瘦肉率高、生長快的優(yōu)點(diǎn)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，迄今為止，在牛、羊、豬、鼠中均發(fā)現(xiàn)有雙肌性狀的表型，甚至在人中也有這種表型的出現(xiàn)。Mepherron等［27］在小鼠骨骼肌cDNA文庫中擴(kuò)增出一段新的序列，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該序列是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）超家族中的成員，是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子。命名為肌肉生長抑制素（MSTN），又稱為生長分化因子8（GDF-8）。研究表明，該基因的缺失或突變就會導(dǎo)致肌肉過度生長或肥大，即雙肌現(xiàn)象。目前科研人員主要應(yīng)用RNAi技術(shù)，特異性敲低MSTN的表達(dá)，從而得到具有雙肌性狀的動物。Jain等［28］設(shè)計4條sh RNA序列，并構(gòu)建了質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到羊成纖維細(xì)胞系中，篩選出兩條高效抑制MSTN的序列，抑制效率分別為80.5%和92.4%。Ajai等［29］應(yīng)用同樣的方法在雞的胚胎成纖維細(xì)胞中也篩選出了具有高效抑制效率的shRNA序列。說明RNAi技術(shù)可以應(yīng)用于動物雙肌性狀的產(chǎn)生。Liu等［30］利用RNAi技術(shù)干擾表達(dá)羊MSTN的同時，伴隨著MyoD和myogenin的上調(diào)，以及Smad3的下調(diào)，該作用機(jī)制與小鼠類似。Hu等［31］構(gòu)建sh RNA表達(dá)載體，隨后利用體細(xì)胞核移植技術(shù)得到5只小羊，其中有3只發(fā)現(xiàn)了shRNA的表達(dá)，抑制了MSTN的表達(dá)，其生長性狀明顯高于其他2只。由此可見，我們可以應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建MSTN干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)基因家畜，從而提到高其產(chǎn)肉性能。

作為營養(yǎng)來源的奶制品是人們尤其是嬰兒的必須品之一，但由于β乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）作為一種主要的抗敏原的存在（占牛乳清蛋白總量的56%-60%）使部分人群不能利用乳產(chǎn)品。為了去除抗敏原，科研人員采用很多方法（如熱處理、酶解、發(fā)酵、糖基化和 Maillard反應(yīng)等）并沒起到良好作用［32-34］。Zhang等［35］曾構(gòu)建 BLG 過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到山羊胚胎成纖維細(xì)胞中，同時用慢病毒介導(dǎo)的shRNA表達(dá)載體感染該細(xì)胞，使shRNA表達(dá)體系穩(wěn)定的整合到山羊基因組中，由此獲得了在胚胎成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。這為干擾表達(dá)BLG的轉(zhuǎn)基因羊的生成提供了理論依據(jù)。

RNAi技術(shù)應(yīng)用于改善畜禽的生產(chǎn)性狀主要是利用siRNA敲低某個對生產(chǎn)性狀不利的基因，并將該siRNA的表達(dá)體系整合到宿主基因組中，再通過體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚，以期得到可以穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因個體。但是轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建仍然是生物學(xué)的難點(diǎn)，而且其成本依然很高。這些都嚴(yán)重影響著RNAi技術(shù)在這方面的應(yīng)用。Matoba等［36］利用RNAi敲低了小鼠重構(gòu)胚中Xist基因（負(fù)責(zé)X染色體失活的基因），使重構(gòu)胚的存活率比對照組高十倍。結(jié)果表明利用體細(xì)胞核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的方法還是有希望應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的。

4 問題與展望

自RNAi現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來，其一直成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并以其顯著的優(yōu)勢迅速發(fā)展成一項(xiàng)研究反向遺傳學(xué)強(qiáng)有力的工具。但就目前的研究來看，RNAi的作用機(jī)制尚不完全清楚，同時對基因功能的復(fù)雜性認(rèn)識仍然很匱乏。即使利用慢病毒介導(dǎo)將siRNA整合的宿主基因組中，并得到穩(wěn)定表達(dá)，但是對生物的整個生命過程是否有影響，我們?nèi)匀徊磺宄?。?yīng)用RNAi技術(shù)還存在一些安全性問題，由于siRNA片段可以降解與其同源的RNA，在對動物疾病的治療過程中，siRNA也有可能將宿主內(nèi)源RNA同時降解，對動物造成不同程度的損傷甚至死亡。Grimm等［37］將大劑量的sh RNA注入到小鼠體內(nèi)時，使部分小鼠細(xì)胞內(nèi)的正常RNA功能受到干擾，嚴(yán)重者甚至死亡。這表明我們在應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療時一定要更加謹(jǐn)慎。有研究報道，RNAi也可以引起自身的防御機(jī)制，如干擾素反應(yīng)，這一防御反應(yīng)也會造成機(jī)體自身的損害。RNAi技術(shù)在對疾病治療的應(yīng)用方面取得了不少成果，但這其中還是存在著一些問題，用RNAi進(jìn)行疾病治療時其效果無法保證，即使應(yīng)用軟件設(shè)計得分很高的siRNA片段，其抑制效果仍然有可能很低。在對病毒性疾病治療的過程中，往往會出現(xiàn)病毒逃逸的突變體，導(dǎo)致RNAi無法識別。因此RNAi的應(yīng)用仍然存在著很多問題，如RNAi抑制效果的時效性，啟動子、載體的選擇等都有待解決。

RNAi雖然還存在著諸多問題，但還是為人們研究基因功能提供了新的方法和思路。RNAi的出現(xiàn)同時也給HIV、脊髓灰質(zhì)炎、丙肝和腫瘤等疾病的治療帶來希望。隨著RNAi分子機(jī)制的進(jìn)一步揭示及其技術(shù)實(shí)現(xiàn)策略的不段改進(jìn)，RNAi將很快應(yīng)用到更多的大型動物模型上，而且RNAi的高通量應(yīng)用也將實(shí)現(xiàn)，這勢必會更好地造福于人類。

［1］ 唐中偉，馮亦平.RNAi在哺乳動物中的研究新進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（4）：67-72.

［2］ Caplen N J，Parrish S，Imani F，et al.Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（17）：9 742-9 747.

［3］ Elbashir S M，Lendeckel W，Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs［J］.Genes ＆ Development，2001，15（2）：188-200.

［4］ 陳貴元，譚德勇.RNA干擾的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景［J］.大理學(xué)院學(xué)報，2012，11（10）：52-55.

［5］ Kuan-Teh Jeang.RNAi in the regulation of mammalian viral infections［J］.Jeang BMC Biology，2012，10：58.

［6］ Okamura K，Lai EC：Endogenous small interfering RNAs in animals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9：673-678.

［7］ Golden D E，Gerbasi VR，Sontheimer E J.An inside job for siRNAs［J］.Mol Cell，2008，31：309-312.

［8］ Rother S，Meister G.Small RNAs derived from longer non-coding RNAs［J］.Biochimie，2011，93：1 905-1 915.

［9］ Jiangnan Li，Yajuan Dai，et al.In vitro inhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression［J］.Antiviral Research，2011，91：209-216.

［10］ 宋紅芹，姜翠翠，張鑫宇等.非洲豬瘟病毒NP419L基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（1）：9-14.

［11］ Ke Lv，Yingjun Guo，Yiliang Zhang，et al.Transient inhibition of foot-and-mouth disease virus replication by siRNAs silen-cing VP1 protein coding region［J］.Veterinary Science，2009，86：443-452.

［12］ Wei Cong，Hong Jin，Cheng Dajiang，et al.Attenuated Salmonella choleraesuis-mediated RNAi targeted to conserved regions against foot-and-mouth disease virus in guinea pigs and swine［J］.Veterinary Research，2010，41（3）：30-46.

［13］ Kim Su-Mi，Jong-Hyeon Park，Kwang-Nyeong Lee，et al.Enhanced inhibition of foot-and-mouth disease virus by combinations of porcine interferon-aand antiviral agents［J］.Antiviral Research，2012，96：213-220.

［14］ Mallucci G，Dickinson A，Linehan J，et al.Depleting neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis［J］.Science，2003，302（5646）：871-874.

［15］ Yongjun Li，Wenting Li，Taikun Li，et al.Construction of RNAi Expressing Vector Targeting the Goat Prion Protein（PRNP）［J］.Animal and Veterinary Advances，2012，11（8）：1 208-1 212.

［16］ Michael C.Golding，Charles R.Long，Michelle A.Carmell，et al.Suppression of prion protein in livestock by RNA interference［J］.PNAS，2006，103（14）：5 285-5 290.

［17］ Renfu Yin，Zhuang Ding，Xinxin Liu，et al.Inhibition of Newcastle disease virus replication by RNA interference targeting the matrix protein gene in chicken embryo fibroblasts［J］.Journal of Virological Methods，2010，167：107-111.

［18］ Hua YUE，Dingfei Li，Anjing Fu，et al.shRNA-triggered RNAi inhibits expression of NDV NP gene in chicken embryo fibroblast［J］.Front.Biol.China，2008，3（4）：433-438.

［19］ Fougerolles A，Vornlocher H.P，Maraganore J，et al.Interfering with disease：a progress report on siRNA-based therapeutics［J］.Nat.Rev.Drug Discov，2007，6：443-453.

［20］ Henshaw J W，Yuan F.Field distribution and DNA transport in solid tumors during electric field-mediated gene delivery［J］.Pharm Sci，2008，97：691-711.

［21］ Ehlert E M，Eggers R，Niclou S P，et al.Cellular toxicity following application of adeno-associated viral vector-mediated RNA interference in the nervous system［J］.BMC Neurosci，2010，11：20.

［22］ Chen M，Payne W S，Dunn J R，et al.Retroviral delivery of RNA interference against Marek＇s disease virus in vivo［J］.Poult Sci，2009，88：1 373-1 380.

［23］ Stephanie Rivera，F(xiàn)an Yuan.Critical Issues in Delivery of RNAi Therapeutics In Vivo［J］.Current Pharmaceutical Biotechnology，2012，13：1 279-1 291.

［24］ Howard B A，F(xiàn)urumai R，Campa M J，et al.Stable RNA interferencemediated suppression of cyclophilin A diminishes nonsmall-cell lung tumor growth in vivo［J］.Cancer Res，2005，65：8 853-8 860.

［25］ Chen W，Liu M，Jiao Y，et al.Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo［J］.Virol，2006，80：3 559-3 566.

［26］ T?nges L，Lingor P，Egle R，et al.Stearylated octaarginine and artificial virus-like particles for transfection of siRNA into primary rat neurons［J］.RNA，2006，12：1 431-1 438.

［27］ Mepherron A C.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-BsuPerfamily member［J］.Nuture，1997，387：83-90.

［28］ Hemlata Jain，Sanjeev Singh，Megha Kadam，et al.Knockdown of the myostatin gene by RNA interference in caprine fibroblast cells［J］.Journal of Biotechnology，2010，145：99-102.

［29］ Ajai K Tripathi，Mansi K Aparnathi，Sagar S Vyavahare，et al.Myostatin gene silencing by RNA interference in chicken embryo fibroblast cells［J］.Journal of Biotechnology，2012，160：140-145.

［30］ Chenxi Liu，Wenrong Li，Xuemei Zhang，et al.The critical role of myostatin in differentiation of sheep myoblasts［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，422：381-386.

［31］ Shengwei Hu，Wei Ni，Wujiafu Sai，et al.Knockdown of Myostatin Expression by RNAi Enhances Muscle Growth in Transgenic Sheep［J］.PLoS ONE，2013，8（3）：e58521.

［32］ Hattori M，Miyakawa S，Ohama Y，et al.Reduced immunoge-nicity of b-lactoglobulin by conjugation with acidic oligosaccharides［J］.Agr Food Chem，2004，52：4 546-4 553.

［33］ Ehn B M，Allmere T，Telemo E，et al.Modification of IgE binding to b-lactoglobulin by fermentation and proteolysis of cow＇s milk［J］.Agr Food Chem，2005，53：3 743-3 748.

［34］ Bu G，Luo Y，Lu J，et al.Reduced antigenicity of b-lactoglobulin by conjugation with glucose through controlled Maillard reaction conditions［J］.Food Agr Immunol，2010，21：143-156.

［35］ Shumin Zhang，Kai Xiong，Zhourui Xie，et al.Stable silencing of-lactoglobulin（BLG）gene by lentivirus-mediated RNAi in goat fetal fibroblasts［J］.Genetics and Molecular Biology，2012，35（3）：680-685.

［36］ Shogo Matoba，Kimiko Inoue，Takashi Kohda，et al.RNAimediated knockdown of Xist can rescue the impaired postimplantation development of cloned mouse embryos［J］.PNAS，2011，108（51）：20 621-20 626.

［37］ Grimm D，Streetz K L，Jopling C L，et al.Farality in mice due to oversaturation of cellular microRNA／short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，44l（7092）：537-541.